Оптимизация течения ферментативной реакции с участием алкогольдегидрогеназы печени лошади при варьировании концентрации никотинамидадениндинуклеотида

Алкогольдегидрогеназа – фермент класса оксидоредуктаз, катализирующих процессы окисления никотинамидадениндинуклеотидом (НАД) первичных алифатических спиртов в соответствующие альдегиды. Имеющиеся в научной литературе данные об ингибиторах АДГ указывают на перспективность расширения круга соединений (особенно азотсодержащих органических веществ), способных действовать в качестве эффекторов фермента, а также разработки ферментативного метода определения их влияния на каталитические свойства фермента [1; 2; 9].

Наибольший интерес в последнее время вызывает фармакологический препарат пирацетам, оказывающий влияние на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы, но до конца не изученный. Фармакологические и физиологические характеристики ноотропного препарата пирацетам подробно описаны в [4; 7].

С целью выявления и создания оптимальных условий течения ферментативного процесса, катализируемого АДГ печени лошади, изучены особенности ферментативной кинетики в присутствии пирацетама при варьировании концентрации НАД. В [7] изучена аналогичная система, состоящая из пирацетама, этанола, АДГ и НАД, но лишь при одной концентрации НАД,

Цель работы – поиск оптимальных концентраций НАД для эффектного течения катализа АДГ печени лошади в системе, включающей пирацетам.

Методика.    Для изучения каталитической реакции в спектрофотометрическую кювету помещали 0,1 мл пирацетама (1,5⋅10-2М),

0,1 мл раствора субстрата НАД (0,5 - 10 " ²М, 1,0 - 10^-2М, 1,5 - 10 " ²М, 2,5 - 10^-2М, 4,5 - 10^-2М), 0,1 мл раствора субстрата этилового спирта (1,5-10^-2М) 0,1 мл АДГ (2,41∙10^-4М). Содержимое кюветы быстро перемешивали и определяли оптическую плотность (D) при длине волны 345 нм в течение 5 мин через каждые 15 с на спектрометре «Specol». Контрольная кювета не содержала субстрата (субстрат заменяли бидистиллированной водой).

Ферментативная реакция сопровождается восстановлением НАД. Конечным продуктом ферментативной реакции является уксусный альдегид [ 3; 7; 11 ] .

Объект исследования – фермент АДГ печени лошади – очищенный, гомогенный, коммерческий препарат фирмы «Reanal» (Венгрия).

Активность рассчитывали, исходя из данных изменения оптической плотности D во времени течения ферментативной реакции. Строили кинетические кривые (D - t) [ 6; 8; 10 ] , на основе которых в рамках подхода Лайнуивера – Берка рассчитали ферментативные параметры: максимальную скорость ферментативной химической реакции (Vmax), константу Михаэлиса (Кm) и константу каталитическую (Ккат).

Результаты и их обсуждение. Экспериментальная часть включала выполнение следующих этапов.

I этап. Определение кинетических параметров каталитической активности АДГ в системе сравнения, состоящей из АДГ (2,41∙10^-4М), НАД (1,5 - 10^-2М) и С 2 Н 5 ОН (1,5 - 10^-2М) в условиях рН 6,0 - система 1. Система 1 явилась системой контроля и подробно изучена и описана в [7].

II этап. Определение ферментативных параметров каталитической активности АДГ в системе, включающей фермент АДГ (2,41∙10^-4М), С 2 Н 5 ОН (1,5 - 10^-2М), пирацетам (1,5 - 10^-2М), при варьировании концентраций НАД (0,5 - 10^-2М, 1,0 - 10^-2М, 1,5 - 10^-2М, 2,5 - 10^-2М, 4,5 - 10^-2М) в условиях рН 6,0 – система 2 .

Используя оценочный подход, подробно описанный в [7], получили первичные экспериментальные данные, а именно кривые D – t (рис. 1) при варьировании концентрации НАД, но при фиксированных концентрациях пирацетама, АДГ, С 2 Н 5 ОН.

К полученным кинетическим кривым в области насыщения построена линия тренда. Это позволило провести экспериментальное определение одного из важнейших ферментативных показателей – максимальной скорости ферментативной химической реакции (Vmax). Рассчитанные значения Vmax и константы Михаэлиса (Кm) приведены в табл. 1.

Видно, что значение Km определяется концентрацией НАД. Наибольшее значение выявлено при концентрации НАД, составляющей 0,5∙10-2М; наименьшее – при 4,5∙10-2М. Характер изменений значений Кm – плавно убывающий с возрастанием концентрации НАД от 0,5∙10-2М до 4,5∙10-2М.

Рис.1. Зависимость оптической плотности (D) во времени (t) системы, содержащей АДГ (2,41 ⋅ 10^-4М), пирацетам (1,5 ⋅ 10^-2М), С 2 Н 5 ОН (1,5∙10^-2М) и НАД различных концентраций: а – 0,5∙10^-2М, b – 1,0∙10^-2М, c – 1,5∙10^-2М, d – 2,5∙10^-2М, e – 4,5∙10^-2М, рН 6,0

Таблица 1

Важнейшие ферментативные параметры (Vmax и Km) системы, содержащей АДГ печени лошади (2,41 • 10 -4 М), пирацетам (1,540^-2М), С 2 Н 5 ОН (1,5∙10^-2М) с добавлением НАД различных концентраций, рН 6,0

Концентрация НАД, • 10-2М	D (при t=15 с)	D(при t=135с)	ΔD	Δt, с	ΔD/Δt= Vmax, • 10-5 у.е.	Km (при Vmax/2), • 10-5моль/л	Km ср , ∙10-5 моль/л
0,5	0,3798	0,4067	0,0269	135	19,94	9,97	5,89 ±0,00
1,0	0,4445	0,4685	0,024	135	17,6	8,8
1,5	0,4795	0,4904	0,0109	135	8,1	4,05
2,5	0,5429	0,5626	0,0097	135	7,16	3,58
4,5	0,7971	0,8055	0,0084	135	6,18	3,09

Итак, оптимальное взаимодействие фермента с субстратом наблюдается для концентрации НАД, составляющей 4,5∙10-2М. Однако Vmax достигает наибольшего значения для концентрации НАД, равной 0,5∙10-2М: концентрация НАД возрастает, а значения Кm и Vmax равномерно уменьшаются.

Для большей детализации условий эффективного функционирования изучаемой ферментативной системы применили второй подход, подробно описанный в [7].

Обработка экспериментальных данных с использованием подхода, предложенного Лайнуивером – Берком, успешно применена в [7]. Полученные значения начальных скоростей (Vо) представлены в табл. 2.

Таблица 2 Рассчитанные значения начальных скоростей (Vо) ферментативных реакций для различных концентраций НАД в системе, содержащей АДГ печени лошади, пирацетам, С 2 Н 5 ОН и НАД различных концентраций, рН 6,0

Система 1	Концентрация НАД, ∙ 10-2М	V 0 , ∙ 10-5 опт.ед./с
	0,5	5,98
	1,0	8,35
	1,5	10,9
	2,5	9,19
	4,5	11,33

Далее экспериментальные данные представили в координатах двойных обратных величин, откладывая по оси Y - 1/Vo, а по оси X - 1/ [ S ] (рис. 2).

На продолжении оси абсцисс прямая отсекает отрезок – 1/Кm, численно равный 19,3∙103 М-1 , а на оси ординат – отрезок 1/Vmах, численно равный 8,33∙103мМ-1мин. Константу каталитическую (Ккат) вычисляли по формуле

Ккат = Vmах/[Ео].

Рассчитали следующие значения Кm, Ккат, Vmах в ферментативной системе 2 (рН 6,0), содержащей АДГ печени лошади (2,41∙10^-4М), пирацетам (1,5∙10^-2М), С 2 Н 5 ОН (1,5∙10^-2М) и НАД различных концентрации:

Кm = 5,01∙10^-5 моль/л;

Vmах=12∙10-5опт.ед./с;

Ккат=4,97∙10^-1 с^{- 1} .

Обнаружена корреляция ферментативных параметров Кm и Vmах, определенных по 1-му и 2-му подходам, а именно среднее значение Кm (моль/л), рассчитанное с использованием первого подхода, составило 5,89∙10-5±0,00, второго подхода –5,01∙10-5±0,00.

Рис. 2. Зависимость обратных величин начальных скоростей от обратных величин концентрации НАД для водного раствора АДГ (2,41∙10-4М), рН 6,0

Итак, нами установлено, что для концентрации НАД, равной 5,01∙10^-5М, достигаются оптимальные условия течения ферментативной реакции. Найдены эффективные соотношения концентрации всех компонентов в системе, содержащей АДГ печени лошади (2,41∙10^-4М), С 2 Н 5 ОН (1,5∙10^-2М), пирацетам, С 2 Н 5 ОН (1,5∙10^-2М), НАД (5,01∙10^-5М). Каталитические параметры в этой же ферментативной системе также оптимальны: Кm = 5,01∙10^-5 моль/л, Vmах=12∙10^-5опт.ед./с, при рН 6,0.

OPTIMIZATION OF CURRENT FERMENTATIVNOY OF REACTION WITH PARTICIPATION ALKOGOLDEGIDROGENASE A LIVER OF A HORSE AT THE VARIATION OF CONCENTRATION

The Tver State University

Are studied classical approach fermentative kineticses, as follows, are received and studied kinetic dependencies of the change to absorbances D at time t(had a standard type crooked with saturation) for system, including ADG, НАД and piracetam. In the field of saturation kinetic crooked is built lines trend and is calculated the most most important fermentativs to factors - a maximum velocities fermentative to chemical reaction (Vmax), constants Mihaelisa (Km) and constants catalytic (Kkat). They Are Found optimum for operating ADG condition of the using piracetam, which can serve the practical recommendation at treatment by sick chronic alcoholism.