Оптимизация выбора растений для биоремедиации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами в условиях Южной Сибири

Введение. Одним из важных факторов загрязнения окружающей среды, в том числе почвы, являются нефть и нефтепродукты. Большинство травянистых растений чувствительны к загрязнению почвы нефтью, но в разной степени [1–4].

Биоремедиация является одним из наиболее действенных, быстрых, экологически безопасных и эффективных с экономической точки зрения методов восстановления загрязненных земель. В процессе своей жизнедеятельности растения входят в сложные взаимоотношения с микроорга- низмами, населяющими почву. В естественных условиях обитания микроорганизмы, окружающие растения, влияют на их рост и развитие. В свою очередь, каждая культура, стимулируя рост, накапливает определенную микробиоту, так как ризосфера растений является зоной, в которой происходит адаптация почвенной микробиоты к условиям, создаваемым активно растущими растениями. Из литературных данных известно, что бобовые формируют в ризосфере комплекс микроорганизмов, многие из которых могут разлагать углеводороды нефти и нефтепродуктов до более простых соединений. Но для того, чтобы из множества аборигенных видов растений и микроорганизмов выбрать подходящие для использования в биоремедиационном процессе, необходимо оценить их устойчивость к загрязнению нефтью и нефтепродуктами.

Под воздействием различных концентраций нефти у растений замедляется рост, нарушаются функции фотосинтеза и дыхания, изменяется структура хлоропластов, в значительной мере страдают корневая система, листья, стебли, репродуктивные органы [5].

Некоторые исследователи отмечают, что первоначально нефть может выступать как биологический стимулятор при низких уровнях загрязнения, тогда как высокие дозы приводят к длительно необратимым изменениям микробиологических свойств почв, в дальнейшем к модификации водновоздушного режима [4, 6].

Таким образом, то, что нефть оказывает значительное негативное воздействие на жизнедеятельность высших растений, едва ли является дискуссионным вопросом. Вместе с тем при более детальном рассмотрении воздействия нефти на конкретные морфологические или биохимические параметры, которые могли бы использоваться в качестве индикационных показателей состояния растений при загрязнении почвы нефтью, трудно сделать однозначные выводы. Необходимо найти метод, позволяющий на ранних стадиях и в достаточно короткий срок определить степень повреждения растений для принятия соответствующих мер. Одним из таких перспективных подходов является метод, основанный на регистрации параметров замедленной флуоресценции хлорофилла [7]. Согласно современным представлениям, флуоресценция хлорофилла, и в первую очередь кинетические характеристики этого процесса, могут служить показателями структурных и функциональных свойств фотосинтетических мембран у растений и использоваться при разработке методов экспресс-анализа влияния различных факторов на фотосинтетическую активность хлоропластов [8–10].

Методы, объекты и район исследования. В качестве объектов исследования были взяты козлятник лекарственный – Galega officinalis , лядвенец рогатый – Lotus corniculatus , люцерна посевная или синяя – Medicago sativa , люцерна серповидная или желтая – Medicago falcata . Для выращивания растений использовали серую лесную почву, взятую в лесном массиве в окрестностях города Красноярска. В процессе эксперимента в контейнеры с почвой были добавлены нефть, дизельное топливо, бензин марки АИ-92 в массовой доле 5 %, а также – контрольные образцы. В каждый контейнер посажено по 100 семян растений каждого из исследуемых видов. Растения выращивались в течение двух месяцев, затем были проведены замеры их морфологических показателей и параметров замедленной флуоресценции хлорофилла листьев.

Для измерения показателей замедленной флуоресценции (ЗФ) хлорофилла использовали разработанный на кафедре экологии и природопользования СФУ флуориметр «ФОТОН 10». В качестве относительного показателя замедленной флуоресценции (ОПЗФ) было взято отношение значений интенсивности быстрой и медленной компонент затухания свечения, измеряемых на свету высокой (120 вт/м2) и низкой (10 вт/м2) интенсивности соответственно. Данный параметр характеризует активность фотосинтетического аппарата и является хорошим индикатором устойчивости растений к неблагоприятным факторам [11].

С целью оценки устойчивости ризосферной микрофлоры к загрязнению нефтепродуктами анализировали общую численность органотрофных ризосферных бактерий путем высева почвенных разведений (106–108) на плотный питательный агар в чашки Петри [12]. Посевы инкубировали при 30°С, учет микроорганизмов проводили на 3-7-е сутки. Выделение углеводородокисляющих микроорганизмов из образцов почвы проводили на минеральной среде с добавлением стерильной сырой нефти в качестве единственного источника углерода и энергии [12]. Идентификацию микроорганизмов производили методом масс-спектрометрии с использованием MALDI-TOF MS. Для анализа масс-спектров использовали программное обеспечение фирмы Bruker Daltonics (Германия): FlexControl 2.4.

Образцы нефти были взяты с месторождения Кумколь (Республика Казахстан) из скважины 1125. Изучение состава и свойств кумкольской нефти весьма важно для понимания ее воздействия на живые организмы. Нефть месторождения Кумколь малосернистая (серы 0,47%), парафинистая (парафина 14,3 % с температурой застывания минус 6,5°С), содержание асфальтено-смолистых компонентов колеблется от 2,85 до 5,45 %, коксуемость 1,64 % [13, 14]. Из нефтепродуктов были взяты бензин марки АИ-92 [15] и дизельное топливо [16].

Результаты и их обсуждение. Наибольшее снижение всхожести семян было отмечено при загрязнении почвы нефтью (табл.). Оценивая видовые различия всхожести семян, нужно отметить, что у семян козлятника лекарственного ( Galega officinalis ) минимально уменьшается всхожесть, а максимальное снижение всхожести семян зарегистрировано у люцерны синей ( Medicago sativa ).

Всхожесть семян и масса растений при загрязнении почвы нефтью и нефтепродуктами

Вариант опыта	Вид растений	Длина, см	Длина, % к контролю	Масса, г	Масса, % к контролю
Почва+ нефть	Medicago falcata	2,0±0,10	69,6	2,0±0,11	52,7
	Galega officinalis	1,6±0,08	91,0	1,8±0,09	83,8
	Medicago sativa	1,6±0,08	69,5	2,0±0,10	94,7
	Lotus corniculatus	1,7±0,09	90,9	1,9±0,10	77,4
Почва+ ДТ	Medicago falcata	2,1±0,11	75,0	2,7±0,14	70,2
	Galega officinalis	1,4±0,08	80,9	1,9±0,11	88,1
	Medicago sativa	2,2±0,11	92,4	2,7±0,13	130,1
	Lotus corniculatus	2,0±0,10	105,9	2,4±0,12	98,8
Почва+ бензин	Medicago falcata	2,2±0,12	78,6	3,2±0,17	84,1
	Galega officinalis	1,5±0,08	83,2	2,7±0,13	129,5
	Medicago sativa	2,2±0,11	94,9	2,1±0,11	102,4
	Lotus corniculatus	1,8±0,08	96,3	2,0±0,12	82,3
Почва, контроль	Medicago falcata	2,8±0,13	100,0	3,8±0,18	100,0
	Galega officinalis	1,8±0,10	100,0	2,1±0,11	100,0
	Medicago sativa	2,4±0,11	100,0	2,1±0,10	100,0
	Lotus corniculatus	1,9±0,10	100,0	2,4±0,13	100,0

Результаты, полученные при регистрации параметров замедленной флуоресценции (рис. 1), согласуются с данными по биомассе выращенных растений (табл.). Наибольшее снижение показателей замедленной флуоресценции отмечено у люцерны серповидной, этот вид оказался самым чувствительным к загрязнению нефтью и нефтепродуктами.

Наиболее устойчивые виды – козлятник лекарственный и люцерна посевная, где интенсивность замедленной флуоресценции, а следовательно, и скорость фотосинтеза увеличились. Это свидетельствует, что эти растения, попадая в неблагоприятные условия, увеличивают скорость метаболизма для повышения устойчивости. Таким образом, нефть и нефтепродукты в массовой доле 5 % не наносят ощутимого вреда растениям этих видов.

ОПЗФ, отн.ед.

• □    Medicago falcata

• ■    Medicago sativa

• ■    Lotus corniculatus

• ■    Galega officinalis

почва+нефть почва+ДТ почва+бензин контроль

Рис. 1. Относительный показатель замедленной флуоресценции хлорофилла листьев исследуемых растений

Микробиологический анализ прикорневой микробиоты показал отсутствие четкой зависимости нарастания численности прикорневой микрофлоры разных растений от типа вносимого нефтепродукта. Тем не менее можно отметить резко положительную динамику численности органотроф-ных бактерий при воздействии сырой нефти и бензина в большинстве исследованных образцов растений (рис. 2). Наименьший прирост численности ризосферных микроорганизмов был отмечен при внесении дизельного топлива, а в варианте с Lotus corniculatus даже наблюдалось снижение численности бактерий в 2,4 раза по сравнению с контролем. Это может быть связано с пониженной способностью микроорганизмов к биотрансформации углеводородов более тяжелой фракции.

Высокую чувствительность к нефтепродуктам проявили бактерии ризосферы люцерны посевной ( Medicago sativa) , их численность увеличилась в 10–1000 раз по сравнению с контролем. Наиболее устойчивой к загрязнению нефтепродуктами микрофлорой обладал козлятник лекарственный ( Galega officinalis) , так как численность бактерий в ризосфере этого вида достоверно не отличалась от контроля.

Рис. 2. Численность ризосферных бактерий (млн КОЕ в 1 г почвы) при загрязнении почвы нефтью и нефтепродуктами

Методом масс-спектрометрии идентифицированы виды, входящие в сообщество ризосферных микроорганизмов и использующие углеводороды нефти в качестве субстрата. Выделенные микроорганизмы представлены родами Bacillus (B.pumilus, B.cereus) , Rhodococcus (R.fascians) и Pseudomonas (Ps. congelans, Ps. monteilii, Ps. grimontii, Ps. koreensis ). Эти представители, согласно литературным данным [17], являются активными деструкторами углеводородов нефти.

Таким образом, учитывая показания замедленной флуоресценции хлорофилла и данные по накоплению почвенной микробиоты в прикорневой зоне исследуемых растений, в качестве перспективного фиторемедианта почв, загрязненных углеводородами нефти, можно рекомендовать козлятник лекарственный ( Galega officinalis ). Для повышения эффективности очистки почв от неф-тезагрязнителей интерес представляет комплексное использование Galega officinalis и сообщества выделенных микроорганизмов – деструкторов нефти.