Опыт использования молекулярно-генетических исследований при цитологической диагностике серозной карциномы яичников в КГБУЗ "Алтайский краевой онкологический диспансер"

Молекулярно-генетические методы все больше используются для диагностики, прогноза и выбора оптимальной терапии онкологических больных. Назначение таргетных препаратов показано только для определенной группы пациенток, у которых в опухолевых клетках выявляется мишень действия этих препаратов. В настоящее время в научных и клинических исследованиях изучается возможность применения и эффективность таргетных препаратов при карциноме яичников:

• 1.    Для поддерживающего лечения пациенток с рецидивирующей high grade серозной карциномой яичников с мутацией гена BRCA, у которых регистрировался ответ на терапию препаратами платины;

• 2.    Low grade серозной карциноме яичника с мутациями гена BRAF у пациенток, ранее получивших несколько линий химиотерапии и гена KRAS, для которого таргетные препараты в перспективе будут использоваться при лечении.

ОНКОГИНЕКОЛОГИЯ

Для назначения таргетных препаратов необходима точная диагностика с определением наличия мутаций в клетках опухоли. В качестве материала для молекулярно-генетического исследования чаще всего используются фрагменты опухолевой ткани, полученные в ходе операции или биопсии. В отечественной научной литературе отмечены немногочисленные работы использования цитологического материала для получения ДНК из клеток опухоли для проведения молекулярно-генетических исследований.

Цель работы. Оценить возможности использования молекулярно-генетических исследований при цитологической диагностике серозной карциномы яичников.

Материалы и методы. В исследование включено 44 пациентки, пролеченные в КГБУЗ «Алтайский краевой онкологический диспансер» в 2015 году. Использованы клинические данные пациенток и образцы их ДНК, выделенные из цитологических препаратов, которые были окрашены по методу Паппенгейма, изготовлены с применением традиционного центрифугирования и использованием монослойной центрифуги Cytospin-4, а также препаратов пункции лимфатических узлов. Цитологические образцы были получены из асцитической жидкости (n=29), пункции через задний свод влагалища (n=10) и лимфатических узлов (n=5): паховых (3) и забрюшинных (2).

В цитологических препаратах оценивали количество опухолевых клеток (не менее 200) и их процентное соотношение с остальным клеточным составом. Отобранные комплексы клеток опухоли на стеклопрепарате отмечали маркером. Клеточный материал растворяли каплей лизирующего раствора и отбирали пипеткой в пробирку типа Эппендорф. ДНК, полученную из цитологических препаратов, выделяли с помощью набора «QIAamp DNA Mini Kit» (Qiagen, Германия), по стандартным протоколам, в автоматическом режиме на станции QIAcube. Оценивали статус генов KRAS, BRAF и BRCA 1/2. Исследование статуса генов KRAS и BRAF осуществляли методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени с предварительной оценкой концентрации полученной ДНК в контрольной ПЦР-реакции. В случае исследования генов BRCA1/2 ПЦР-реакцию проводили в один этап с одновременным сопоставлением с отрицательным и положительным ДНК стандартами. Исследовали следующие мутации: в гене KRAS – G12C, G12S, G12R, G12V, G12D, G12A, G13D и V600E гена BRAF, в гене BRCA1–5382insC, 4153delA, 185delAG, T300G; в гене BRCA2–6174delT. Мутации в изучаемых генах детектировали методом аллель-специфической ПЦР с помощью наборов real-time-PCR, производства ООО «Биолинк» (Россия), на приборе «CFX-96» (США).

Результаты. По цитологической картине пациентки с серозной карциномой яичника были разделены на группы high grade (n=36) и low grade (n=8). Пациентки первой группы были почти на 10 лет старше пациенток второй группы, в возрасте 60,73±10,47 и 51,29±21,35 соответственно. Для генетического исследования пригодным был материал 41 (93,2%) пациентки, так как в трех случаях концентрация полученной ДНК была недостаточной.

В группе high grade серозной карциномы яичника обнаружены только мутации в гене BRCA1–4 случая из 33 (12,1%), которые были представлены в трех наблюдениях мутацией 5382insC, в одном – T300G. Исследуемые мутации генов KRAS и BRAF во всех наблюдениях этой группы отсутствовали.

В группе пациенток low grade серозной карциномы яичника, генетическая поломка в гене KRAS обнаружена у пяти из восьми (62,5%) женщин, в 4 случаях из них выявлена мутация G12V и в одном случае – G12D. Мутация V600E гена BRAF обнаружена у одной (12,5%) пациентки. Поломки гена BRCA1/2 во всех наблюдениях этой группы отсутствовали.

Заключение. Использование цитологического материала для молекулярно-генетических исследований оправдано для пациентов с местно-распространенным или диссеминированным процессом, у которых цитологический материал является единственно доступным морфологическим материалом для исследования. Проведенное исследование показало, что цитологический материал в большинстве случаев является достаточным для тестирования мутаций у пациенток с серозной карциномой яичника. Специалисты клинической лабораторной диагностики должны знать об ограничениях использования цитологического материала для поиска мутаций в клетках опухоли и рассматривать каждый конкретный случай с акцентом на достаточное количество материала для получения ДНК.

Мутации гена BRCA1 отмечены у 12,1% пациенток группы high grade серозной карциномы яичника. В образцах пациенток группы low grade серозной карциномы мутации гена KRAS обнаружены в 62,5% случаев, гена BRAF – в 12,5%.

В эру персонализированной терапии цитологический метод диагностики позволяет диагностировать карциному яичника с указанием морфологического варианта опухоли, уточнением типа – low и high grade карциномы, а использование молекулярно-генетических исследований является важным дополнением, позволяющим оценивать молекулярный статус опухоли, позволяющий подобрать таргетные препараты для терапии. При этом важное значение имеет взаимодействие между онкогинекологами, цитологами и врачами лаборатории молекулярной диагностики.