Опыт культивирования лекарственных растений на Севере (Республика Коми)

Заготовка многих лекарственных растений в природе не способна обеспечить фармацевтическую промышленность сырьем и, зачастую, ведет к истощению природных ресурсов этих растений. В связи с этим актуальным является возделывание официнальных растений в культуре с целью создания производственных плантаций. Важным шагом на пути к широкому внедрению лекарственных растений является их первичная интродукция в ботанических садах. Изучение закономерностей роста и развития в новых почвенноклиматических условиях позволяет исследовать специфику приспособления растений к новым условиям, провести оценку перспективности видов для культивирования в конкретном регионе.

Цель исследований: интродукционное изучение и разработка способов воспроизводства лекарственных растений Hypericum perforatum, Hedysarum alpinum и Pentaphylloides fruticosa в средней подзоне тайги Республики Коми (РК).

В работе использовались общепринятые методики изучения травянистых и древесных растений при интродукции [2, 3, 5, 11]. Содержание аминокислот, входящих в состав белков растений, определено методом жидкостной хроматографии на ионообменных смолах с использованием аминокислотного анализатора ААА 339 в аккредитованной экоаналитической лаборатории Института биологии Коми НЦ УрО РАН.

Полученные данные статистически обработаны.

Hypericum perforatum L. (зверобой продырявленный) – многолетнее травянистое растение из семейства Hypericaceae . Южнобореальный евразиатский вид с достаточно обширным ареалом. Запасы его в природе незначительны, так как в ценозах он встречается спорадически и редко образует плотные заросли. Средняя урожайность надземной сырьевой фитомассы дикорастущих растений низкая [1]. На территории РК H. perforatum встречается достаточно редко, отмечен в локальных флорах окрестностей сел Визинга и Усть-Кулом [7]. H. perforatum – перспективный продуцент биологически активных веществ – нафтодиантроновых пигментов и флавоноидов, широко используется в народной и научной медицине, входит в фармакопеи многих стран. Препараты на его основе обладают вяжущим, противовоспалительным, антисептическим, антидепрессивным действием, а также воздействуют на вирусы герпеса, гепатита В, парагриппа 3 и др. [10].

В 2004–2009 гг. проведено исследование биологии развития H. perforatum L. – ценного лекарственного растения для введения его в культуру как источника получения высококачественного лекарственного сырья [13]. Объектами изучения стали семь образцов H. perforatum разного географического происхождения. Исходный материал (семена) был получен по обмену из ботанических садов России и привлечен из природы: 1) сорт Золотодолинский, семена репродукции Центрального сибирского ботанического сада СО РАН (ЦСБС, г. Новосибирск); 2) природный образец из Кировской области, собран Т.Л. Егошиной, с.н.с. ВНИИОЗ; 3) Сыктывкар (вторая местная репродукция исходного образца из Ботанического сада Саратовского госуни-верситета); 4) Новосибирск (ЦСБС); 5) Горный Алтай (филиал ЦСБС, с. Камлак); 6) Барнаул (ЮжноСибирский ботанический сад Алтайского госуниверси-тета); 7) Саратов (семена репродукции Ботанического сада Саратовского госуниверситета). Полевой опыт был заложен на однородном выровненном агрофоне в тщательно контролируемых условиях интродукционного питомника. Растения каждого образца были высажены на делянки с площадью питания 40x40 см по 35 экз. каждого образца в двухкратной повторности. Для изучения ранних этапов онтогенеза на отдельные делянки были высажены растения с площадью питания 10×10 см, по 60-80 экз. каждого образца.

Установлено, что в условиях культуры на сред-неокультуренных дерново-подзолистых глееватых почвах суглинистого механического состава H. perforatum развивается как поликарпическое коротко-корневищно-стержнекорневое травянистое растение с симподиальной системой безрозеточных побегов возобновления. В первый год жизни в процессе онтогенеза он проходит последовательно все онтогенетические состояния прегенеративного периода: проростки, ювенильное, имматурное, виргинильное. На второй год жизни особи H. perforatum вступают в молодое генеративное, на третий год переходят в средневозрастное генеративное онтогенетическое состояние, растения четвертого - шестого годов жизни мы также отнесли к средневозрастным генеративным растениям, хотя у них резко снижалось число генеративных побегов на особь по сравнению с растениями третьего года жизни, но морфометрические показатели, характеризующие генеративную сферу, не уступали показателям растений третьего года. Старые генеративные, субсенильные и сенильные растения с угасанием генеративных процессов, на протяжении шести лет стационарных исследований зверобоя продырявленного нами не зафиксированы. Исследование сезонного развития H. perforatum показало, что образцы разного географического происхождения в условиях культуры сохраняют фенологические ритмы, свойственные данному виду. Установлено, что многолетние растения H. perforatum характеризовались растянутыми периодами цветения (52-59 дней) и плодоношения (69-76 дней). Вегетационный период составлял 134-145 дней в зависимости от метеоусловий сезона. Для создания устойчивых и высокопродуктивных плантаций H. perforatum размножают только семенным путем. Проведена морфобиологическая оценка семян, собранных в годы исследований от двух - пятилетних растений H. perforatum . Установлено, что все изучаемые образцы формировали зрелые семена, но их качество зависело от метеорологических условий вегетационного сезона и происхождения образца. По морфометрическим показателям семена сыктывкарской репродукции не уступали семенам исходного материала. Семена H. perforatum мелкие, с массой 1000 шт. семян 0,08-0,12 г. Показатели длины и ширины семян варьировали в зависимости от происхождения образца от 0,83 до 1,14 и от 0,42 до 0,53 мм соответственно. С третьего года жизни все образцы характеризовались высокими показателями энергии прорастания (48-79%) и лабораторной всхожести (6096%), формировали обильный самосев на соседних делянках. Следует отметить, что природный образец из Кировской области, в отличие от образцов, привлеченных из ботанических садов России, в новых условиях выращивания сохранял качества дикорастущего растения: формировал более мелкие семена, энергия прорастания и лабораторная всхожесть которых в благоприятные годы была на 18-35% ниже по сравнению с семенами других образцов.

Выявлено, что максимального развития растения H. perforatum в культуре достигают на третий год жизни: высота 75-98 см, побегообразовательная способность 51-182 шт./особь, масса соцветия 5.0-9.3 г. Начиная со второго года жизни H. perforatum формирует воздушно-сухую сырьевую фитомассу 8-31 г/особь, максимальные значения отмечены на третий год жизни (241-1620 г/особь). В последующие годы продуктивность растений снижалась в 2.8-13.5 раза. Наиболее продуктивными являлись растения из Кировской области, Новосибирска и Барнаула.

Исследована динамика содержания и распределения нафтодиантроновых пигментов (гиперицина и псевдогиперицина) и флавоноидов в сырьевой фитомассе H. perforatum второго - третьего годов жизни. Их сумма в растениях второго года жизни в фазе массового цветения варьировала у шести образцов в пределах 0,055-0,080%, третьего - 0,053-0,072%. В результате определения пигментов методом ВЭЖХ у образцов H. perforatum разного географического происхождения в фазе цветения получены аналогичные данные. Только в образце из Барнаула их массовая доля была достоверно ниже и составляла по данным спектрофотометрического анализа 0,043%, а по данным ВЭЖХ анализа - 0,038%.

Представлялось целесообразным исследование динамики накопления и распределения гиперицина и псевдогиперицина в надземных органах H. perforatum в зависимости от фазы развития. Согласно полученным данным, наименьшим содержанием пигментов характеризовались стебли (0,001-0,003%), далее по возрастающей - плоды (0,013-0,052%), листья (0,023-0,062%), цветки (0,043-0,089%), бутоны (0,076-0,096%). Максимальное содержание наблюдалось в фазах бутонизации и массового цветения с постепенным снижением к плодоношению. Массовая доля суммарного содержания флавоноидов в растениях H. perforatum второго года жизни, определенная спектрофотометрическим методом, составляла 4,0-4,85% и не имела достоверно значимых различий между исследованными образцами.

Изучен аминокислотный состав растений H. perforatum первого и последующих лет жизни в течение одного вегетационного периода. В сырьевой надземной фитомассе обнаружены 17 аминокислот, в том числе 7 незаменимых. Доля незаменимых аминокислот составляла в среднем 37±1% от общего количества. Выявлено, что суммарное содержание аминокислот не зависело от географического происхождения образцов и возраста многолетних растений. Значительные различия по этому показателю установлены между растениями первого года жизни и многолетними растениями четвертого - восьмого годов жизни. Сумма аминокислот у растений первого года жизни была в 1,5-2,8 раза выше, чем у многолетних растений. Долевое же участие каждой аминокислоты в общем содержании было достаточно стабильно и не зависело от географического происхождения образцов, возраста растений и фазы развития. Наибольшие показатели долевого участия отмечены для глутаминовой (14,1%), аспарагиновой (10,6%) кислот, лейцина (8,6%), пролина (8,2%) и лизина (7,6%).

Hedysarum alpinum L. - копеечник альпийский -многолетнее травянистое растение из сем. Fabaceae, отнесен к группе лекарственных растений, не обеспеченных естественной сырьевой базой [6]. H. alpinum включен в Красную книгу РК [4]. Из надземной части этого растения выделен ксантоновый гликозид манги-ферин, обладающий противовирусными свойствами. В предыдущей публикации нами были приведены результаты изучения роста и развития многолетних растений H. alpinum при выращивании в условиях средней подзоны тайги РК. Определена продуктивность надземной фитомассы растений разного возраста и выявлено в ней высокое содержание мангиферина [9]. В этой статье представлены результаты семенного размножения H. alpinum. Возобновление изучаемого вида происходит только семенным путем. Плодоношение многолетних растений наступало в первой декаде августа и заканчивалось в благоприятные по метеоусловиям годы в конце августа, в неблагоприятные – во второй-третьей декадах сентября. Период от начала отрастания до сбора семян составлял в среднем 115 дней, варьируя по годам от 105 до 128 дней. Осыпание зрелых плодов и усыхание растений начиналось в конце августа. Самосев у H. alpinum отмечался всего один раз за весь период изучения данного вида.

Плод H. alpinum – членистый боб, имеющий 2-3 (реже 1-4) членика, распадающихся по ложным поперечным перегородкам на односемянные членики. В условиях интродукции многолетние растения формировали в среднем 17% одночленных, 35-40% – двучленных и трехчленных, 7% четырехчленных плодов. Установлено, что число плодов на побег значительно увеличивалось с возрастом растений. Особи третьего года жизни формировали 213±19, четвертого – шестого - 817±87, седьмого – десятого годов жизни - 1317±115 плодов. Процент плодоцветения варьировал по годам от 47% до 69% и не зависел от возраста растений. Семена H. alpinum бобовидные, гладкие, от темнопесочных до буровато-желтых оттенков, 2,6-3,5 мм длиной и 1,7-2,5 мм шириной. Масса 1000 шт. семян варьировала от 4,2 до 5,8 г в зависимости от года сбора и возраста растений. Семена характеризуются особым типом экзогенного покоя – физическим, который нередко обозначается термином «твердосемянность». Одной из причин такого покоя является водонепроницаемость кожуры. По данным Л.И. Фоминой [12] семена этого вида обладают малопроницаемыми оболочками: за 24 часа они поглощали всего 14% воды. Для нарушения водонепроницаемости кожуры в лабораторных условиях нами были использованы два способа обработки семян: скарификация с использованием мелкой наждачной бумаги и замачивание в концентрированной серной кислоте в трех вариантах: по 5, 10 и 15 мин., с последующим промыванием их водой до нейтральной реакции среды. Выявлено, что оптимальным способом обработки является механическая скарификация семян перед посевом. При этом процент твердых семян снижался в среднем на 57% по сравнению с контролем, а лабораторная всхожесть возрастала на 41-60% как у семян с удалением околоплодника, так и без. При обработке семян серной кислотой во всех вариантах резко снижалось число твердых, но значительно увеличивалось число набухших и заплесневелых семян (до 65%).

Полевая всхожесть семян H. alpinum изучена в микрополевом опыте в 2014 г. Всхожесть скарифицированных семян и без скарификации (контроль) изучалась в двух вариантах: с удалением околоплодника и без удаления. На гряды размножения с междурядьями 70 см подготовленные семена высевали 16 июля по 100 шт. на 1 м погонный, в четырехкратной повторности. Начало прорастания скарифицированных семян (5-8 %) отмечалось на 15 сутки после посева, без скарификации – на 20 сутки, массовое - наблюдалось на 35 сутки после посева. Наибольшие показатели массового прорастания отмечались у скарифицированных семян без удаления околоплодника (33%), наименьшие (10%) – у семян без скарификации и без удаления околоплодника. Близкие знания (до 23%) отмечены у семян в контроле и в варианте со скарификацией и удалением околоплодника. В конце вегетационного сезона (23 сентября), на 70 день после посева, эти значения не изменились. Наилучшая полевая всхожесть (до 35%) отмечена в варианте у скарифицированных семян без удаления околоплодника.

В связи с тем, что семенное размножение H. alpinum достаточно трудоемкий процесс и характеризуется достаточно низкими показателями полевой всхожести семян, в отделе Ботанический сад в 2015 г. начато культивирование растений данного вида в условиях in vitro. В исследованиях на первом этапе культивирования растений H. alpinum в условиях in vitro была разработана схема стерилизации эксплантов (семян), которая позволила достичь 65-98% выхода стерильных и до 77% жизнеспособных эксплантов H. alpinum [8].

В данной статье приводятся результаты изучения роста и развития проростков в культуре in vitro под влиянием фитогормонов. Для проращивания семян in vitro использовали питательную среду по прописи Му-расиге Скуга, без внесения гормонов, а также дополненную регуляторами роста в различных комбинациях и концентрациях. На питательной среде без гормонов и с добавлением БАП 0,5 + ИУК 0,1мг/л массовые проростки появились на 5 сутки, всхожесть составила 85%. На 9 сутки длина корешков в среднем составила 2,1 см на среде с БАП 0,5+ИУК 0,1 мг/л и 4,3 см на безгормо-нальной среде, высота растений 2,9 см и 3,7 см, соответственно. Наличие гормонов в среде сдерживало прорастание семян, всхожесть оставалась высокой, но массовые проростки появились на двое суток позже. Растения, культивируемые на среде дополненной регуляторами роста развивались медленнее, имели утолщенный короткий гипокотиль и недоразвитый корешок 0,2-0,8 см длиной и 0,9-1,5 см высотой (табл. 1). На 30 день культивирования проростки на безгор-мональной среде имели один побег с 5-6 настоящими листьями, на среде с БАП 1,2,3+ ИУК 0,1; 0,2, 0,3 мг/л сформировались растения, имеющие от 1 до 3 побегов, высотой до 6,5 см с числом настоящих листьев от 1 до 3.

Таблица 1. Рост и развитие проростков Hedysarum alpinum в культуре in vitro

Варианты опыта	Всхожесть семян, %	Морфометрические показатели, см
		на 9 сутки	на 16 сутки	на 22 сутки	на 30 сутки
Безгормональная среда	85±4	3.7±0.2* 4.3±0.2	5.8±0.1 6.0±0.2	6.8±0.1 9.3±0.1	10.0±0.3 11.2±0.2
БАП 0.5 + ИУК 0.5	86±4	2.9±0.1 2.1±0.2	3.8±0.1 2.5±0.1	4.4±0.2 2.6±0.1	5.9±0.2 2.7±0.1
БАП 1+ИУК 0.1	84±3	1.5±0.2 0.8±0.1	3.6±0.3 2.2±0.1	4.4±0.3 2.4±0.2	5.2±0.2 2.3±0.2
БАП 2+ИУК 0.2	87±6	1.5±0.06 0.8±0.08	3.5±0.1 1.8±0.1	3.6±0.2 1.7±0.1	6.5±0.2 2.6±0.2
БАП 3 +ИУК 0.3	87±6	0.9±0.1 0.2±0.04	2.2±0.2 1.1±0.09	2.7±0.2 0.9±0.06	5.2±0.2 0.9±0.03

Примечание: в числителе – длина корешка, знаменателе – высота побега

В процессе культивирования растений H. alpinum во втором пассаже использовали стерильные экспланты микрорастений (проростки с удаленными корешками, семядоли, гипокотиль, корешки, семядольный узел, верхушечная часть побега), выращенные на безгормональной среде, которые инокулировали на питательных средах с различным содержанием фитогормонов. В зависимости от типа экспланта наблюдались различные морфогенетические реакции. На среде с содержанием 2,4-Д+ ИУК в концентрациях 1, 2 и 0,1 и 0,2 мг/л, соответственно и 2,4-Д 1 мг/л + кинетин 0,1 мл/л произошла стимуляция каллусогенеза у корешков, семядолей, семядольных узлов и проростков с удаленными корешками. Каллусная ткань более интенсивно образовывалась на семядольном узле, проростках с удаленными корешками и корнях. Каллус на корнях сформировался в небольшом количестве по всей поверхности. Более интенсивное каллусообразование наблюдали на семядольном узле и проростках с удаленными корешками. На контрольной безгормональ-ной среде у проростков с удаленными корешками на девятые сутки наблюдался спонтанный ризогенез (корнеобразование). На остальных эксплантах адвентивных корней не обнаружено. При совместном внесении ауксинов и цитокининов (БАП 1, 2, 3 мг/л и ИУК 0,1, 0,2, 0,3 мг/л) экспланты (проростки, с удаленными корешками и семядольный узел) проявляли наибольшую морфогенную активность. Индукция развития побегов наблюдалась на 10 сутки у 90% эксплантов, однако коэффициент размножения оказался низким и составил 1-2 побега на эксплант. Не удалось получить морфогенного ответа у эксплантов из корней, верхней части побега и семядолей.

Виды рода Pentaphylloides Hill (курильский чай) – семейство Rosaceae Juss. - распространены в Европе, Азии, Северной Америке. На территории бывшего СССР произрастает 6 видов. В дендрарии Ботанического сада испытывались 3 вида - P. davurica (Nestl.) Ikonn. (курильский чай даурский), P. fruticosa (L.) O. Schwarz (курильский чай кустарниковый), P. mandshurica (Max-im.)Sojak (курильский чай маньчжурский) и один гибрид P. x friedrichsenii Hort. (курильский чай Фридрих-сена). Мы подробно изучаем биологию и способы размножения P. fruticosa в условиях культуры в средней подзоне тайги РК. Это реликтовое редкое растение северо-востока европейской части России, включен в Красную книгу РК [4] как уязвимый вид с сокращающейся численностью. Произрастает только в северном полушарии и имеет дизъюнктивный ареал, состоящий из азиатской, европейской и североамериканской частей. Объектами исследования являлись растения P. fruticosa разного географического происхождения: природные образцы из Горного Алтая и Интинского района РК и культивируемый образец из Новосибирска (ЦСБС). Подробно исследованы рост и развитие растений из Горного Алтая, выращенных из семян сыктывкарской репродукции, на начальных этапах онтогенеза.

Плод P. fruticosa - многоорешек, семена с крупным зародышем, окруженным тонким слоем эндосперма. Для ускорения роста и развития растений семена P. fruticosa были высеяны в теплице в начале марта с последующей пересадкой растений в открытый грунт в мае. В первый год жизни в процессе онтогенеза особи последовательно проходили все онтогенетические состояния прегенеративного периода: проростки, ювенильное, имматурное и виргинильное. Вирги-нильные растения к концу вегетационного сезона имели характерные для взрослых растений корневую систему смешанного типа, одревесневающий побег, ветвящийся до второго – третьего порядка высотой 2333 см и перистосложные листья, состоящие из пяти ланцетных листочков. Единичные особи переходили в конце сентября в молодое генеративное онтогенетическое состояние генеративного периода, образуя при этом один разветвленный побег с немногочисленными цветками. Массовый переход растений в генеративный период происходил на втором году жизни. Растения P. fruticosa опыляются насекомыми. Выявлены особенности строения цветка и динамика суточного раскрытия цветков. Они распускались однократно, преимущественно утром, цвели 1-5 дней в зависимости от метеоусловий сезона. Период цветения P. fruticosa в условиях культуры начинался в середине июня и заканчивался в конце сентября - начале октября и составлял 90-100 дней. В процессе развития растений на однородном выровненном агрофоне P. fruticosa формировал два морфотипа: наблюдались особи как с раскидистой (Горный Алтай), так и с компактной формой куста (Новосибирск), что вероятно, следует объяснить их генетическими особенностями. Ежегодно отмечались выполненные семена, наблюдался самосев растений, что является показателями устойчивости вида в новых почвенно-климатических условиях.

В качестве лекарственного сырья у P. fruticosa используются верхушечные одногодичные побеги с цветками и листьями. Установлено достаточно высокое содержание флавоноидов в надземной фитомассе растений, в фазе цветения оно варьировало от 6,5 до 13,0% в пересчете на абсолютно сухое сырье. Содержание флавоноидов у природных образцов оказалось выше, чем у интродуцируемых, но, несмотря на это, последние также могут использоваться в качестве лекарственных растений. Впервые в условиях средней подзоны тайги изучен аминокислотный состав интродуцируемых растений P. fruticosa . Анализировалась надземная сырьевая фитомасса (листья, цветки, бутоны), собранная в фазе цветения с многолетних растений. В сырьевой надземной фитомассе двух образцов P. fruticosa (Горный Алтай и Новосибирск) обнаружено 17 аминокислот, в том числе семь незаменимых. Доля незаменимых аминокислот составляла 40-42% от общего количества. Выявлено, что суммарное содержание аминокислот растений (9,36-9,67%) не зависело от их географического происхождения. Долевое участие каждой аминокислоты в общем содержании у изучаемых образцов также было достаточно стабильно. Наибольшие значения долевого участия отмечены для глутаминовой (11,6-11,9%) и аспарагиновой (10,7-11,6%) кислот, лейцина (10,0 -10,4%), лизина (8,2-8,6%), аланина (6,5-6,6%), аргинина (6,2-6,6%) и глицина (5,96,0%).

Выводы: изучена биология развития и разработаны способы размножения лекарственных растений Hypericum perforatum, Hedysarum alpinum и Penta-phylloides fruticosa при интродукции в средней подзоне тайги РК. Изучен процесс становления жизненной формы H. perforatum в ходе онтогенеза. Установлено, что в условиях культуры происходило ускоренное развитие особей: на второй год жизни растения H. perforatum формировали короткокорневищно-стержне-корневую многолетнюю биоморфу с симподиальной системой безрозеточных побегов возобновления. Впервые в условиях Севера экспериментально обоснована возможность культивирования H. perforatum и P. fruticosa с гарантированным получением высококачественного растительного сырья. Показана способность растений данных видов к семенному размножению и образованию жизнеспособного самосева в новых эколого-географических условиях выращивания, что является критерием высокой интродукционной устойчивости вида. Впервые определена сырьевая продукция H. perforatum в зависимости от возраста растений. В культуре на Севере выявлена динамика накопления нафтодиантроновых пигментов в надземной фитомассе растений H. perforatum и флавоноидов в растениях обоих изучаемых видов. Установлено, что содержание флавоноидов в лекарственном сырье природных образцов P. fruticosa выше, чем у интродуцируемых. Выявлены образцы H. perforatum, характеризующиеся стабильными показателями сырьевой фитомассы с высоким содержанием БАВ: образцы из Горного Алтая, Кировской области и Новосибирска являются наиболее перспективными для селекционной работы и выращивания в среднетаежной подзоне РК. В результате исследования аминокислотного состава сырьевой фитомассы растений H. perforatum и P. fruticosa обнаружено 17 аминокислот, в том числе 7 незаменимых. Показано, что долевое участие каждой аминокислоты в общем содержании не зависело от географического происхождения образцов изучаемых видов.

Изучены особенности семенного размножения и репродуктивные показатели растений H. alpinum . Установлено, что оптимальным способом подготовки семян к посеву является скарификация их с помощью мелкой наждачной бумаги, без удаления околоплодника, что значительно сокращает ручной труд. Из-за трудоемкости семенного размножения H. alpinum начато культивирование растений этого вида в условиях in vitro. Выявлено, что для проращивания семян in vitro на первом этапе возможно использование питательной среды без внесения фитогормонов. Установлено, что введение в среду высоких концентраций БАП (от 1 до 3 мг/л) ингибирует рост и развитие растений и увеличивает число побегов. В качестве эксплантов для дальнейшего размножения целесообразно использовать семядольный узел и проростки с удаленными корешками.

Результаты первичной интродукции изучаемых видов лекарственных растений позволяют выделить наиболее продуктивные образцы, накапливающие максимальное количество БАВ, которые в дальнейшем могут успешно культивироваться в среднетаежной подзоне РК.

• 1.

• 2.

• 3.

• 4.

• 5.

• 6.

• 7.

• 8.

• 9.