Основные аспекты импрессионной цитологии бульбарной конъюнктивы

Импрессионная цитология (ИЦ) (от латинского impressio – воздействие, вдавливание) представляет минимально инвазивный метод цитологического исследования поверхностных слоев глазной поверхности с применением для забора клеточного материала различных сорбирующих аппликаторов или фильтров [1; 2]. Данный метод был разработан в 1977 году двумя группами авторов: доктором R.W. Thatcher и его коллегами, предложившими для получения отпечатков эпителия бульбарной конъюнктивы использовать пластиковое устройство из полистирола в виде диска с рукояткой для обозначения разметки с последующей окраской мазка-отпечатка по Романовскому-Гимзе и красителем эозином -метиленовым синим по Райту [3; 4], и доктором P.R. Egbert и его соавторами, осуществившими забор клеточного материала для проведения ИЦ с помощью аппликаторов из синтетической ацетатцеллюлозной фильтровальной бумаги с последующим окрашиванием полученного клеточного материала периодической кислотой Шиффа и морфологической оценкой клеток бульбарной конъюнктивы и выявление бокаловидных клеток с помощью световой микроскопии [4; 5]. Изучение методики забора и окрашивания клеточного материала продолжили доктор S.C. Tseng со своими соавторами и для повышения точности цитологического исследования добавили гематоксилин в протокол окрашивания клеточного материала реактивом Шиффа [4; 6; 7]. Одним из методов, использовавшихся для визуализации бокаловидных клеток конъюнктивы,

было окрашивание мазка-отпечатка красителем альциа-новым синим, предложенным доктором A.G. Pearse [8]. Альциановый синий избирательно окрашивает кислые мукополисахариды, содержащиеся в муцине бокаловидных клеток, в бирюзовый цвет [8; 9]. Помимо кислых мукополисахаридов бокаловидные клетки могут содержать и нейтральные мукополисахариды, что также требует визуализации при световой микроскопии [9]. Для этой идентификации был предложен способ с использованием реагента Шиффа при выполнении PAS (Шик)-реакции, где бокаловидные клетки, содержащие нейтральные мукополисахариды, приобретали пурпурное окрашивание [9–11]. На сегодняшний день актуальным протоколом окрашивания бокаловидных клеток является сочетанное использование красителя альцианового синего совместно с Шик-реакцией [4; 12; 13].

Традиционно ИЦ используют в верификации патологических процессов, происходящих в бульбарной конъюнктиве при синдроме сухого глаза (ССГ), синдроме Шегрена, плоскоклеточной неоплазии глазной поверхности, синдроме Стивенса-Джонсона, конъюнктивитах, дефицита витамина А, что позволяет контролировать и своевременно определять тактику и способы консервативного лечения таких пациентов [14; 15]. Например, доктор K.S. Khimani со своими коллегами из медицинского колледжа Бейлора США в первой части своего исследования продемонстрировали снижение плотности и уменьшение размера бокаловидных клеток в исследуемой площади у пациентов с диагнозом ССГ испарительной формы и у пациентов с диагнозом ССГ испарительной формы на фоне синдрома Шегрена по сравнению с контрольной группой, где были включены пациенты с исходно нормальным статусом глазной поверхности, и где не отмечалось статистически значимой разницы в распределении плотности и морфометрических параметрах бокаловидных клеток в контрольных сроках наблюдения [16]. В исследовательской работе медицинского факультета Афьонкарахисарского университета Турции у большинства пациентов с саркоидозом отмечались симптоматические признаки сухости глаз, которые подтверждались при выполнении общих стандартных методов исследования глазной поверхности – тест Ширмера-1, определение времени разрыва слезной пленки (ВРСП) и окрашивание глазной поверхности красителем флюоресцеина, а также и при выполнении ИЦ мазков-отпечатков, взятых с височной части бульбарной конъюнктивы, окрашенных PAS-реакцией и красителем гематоксилин-эозином, были обнаружены морфологические изменения характерные для плоскоклеточной метаплазии, более крупные и полигональные эпителиальные клетки с мелкими и пикнотичны-ми ядрами и уменьшенные по количеству и размеру бокаловидные клетки с четко очерченными границами по сравнению с контрольной группой пациентов без саркоидоза и исходно нормальным статусом глазной поверхности, что служит диагностическим маркером введения и контроля лечения пациентов с диагнозом саркоидоз и ССГ [17].

Интересным опытом поделились доктор P. Kumar со своими коллегами из медицинского колледжа Сантоса Индии об отсутствии корреляционной связи чувствительности и специфичности тестов по определению ВРСП, исследованию слезопродукции при выполнении методики Ширмер-1 и окрашиванием глазной поверхности красителем бенгальским розовым и цитологическим исследованием мазков-отпечатков, взятых с нижней части бульбарной конъюнктивы, окрашенных PAS-реакцией, у пациентов с диагнозом ССГ испарительной формы, что послужило доказательным основанием считать результаты ИЦ лучшим предиктором морфологических и цитологических изменений в бульбарной конъюнктиве при постановке диагноза ССГ по сравнению с общепризнанным золотым стандартом [11]. Не менее дискутабельной работой стало исследование корреляции между клеточным биомаркером аутофагической гибели клеток бульбарной конъюнктивы – LC3 при выполнении ИЦ с последующей полимеразной цепной реакцией и стандартными функциональными тестами, определяющих статус глазной поверхности: тест-опросник OSDI, тест Ширмера-1, проба Норна, результаты которой подтвердили отсутствие корреляции между обычно используемыми клиническими диагностическими тестами при ССГ и клеточным биомаркером LC3, что подчеркивает недостаточность доступных клинических инструментов для оценки состояния глазной поверхности и многогранность ксероза глазной поверхности [18].

Исследования в этой области заставляют задуматься о пересмотре общепризнанной концепции золотого стандарта диагностики ССГ в клинической работе офтальмолога.

Диагностические возможности применения ИЦ развиваются и становятся актуальными и в исследованиях молекулярных и клеточных медиаторов воспаления глазной поверхности. За последние несколько лет исследования ИЦ бульбарной конъюнктивы способствовали углубленному пониманию патофизиологии ССГ, а также подтвердили, что воспаление глазной поверхности связано с клиническими проявлениями этого заболевания. Исследования ИЦ бульбарной конъюнктивы прояснили механизм действия воспаления глазной поверхности, где были показаны пусковые звенья Th1-опосредован-ного процесса ССГ – местные поверхностные клетки, выделяемые цитокины, нарушающие баланс глазной поверхности [14; 19]. Воспалительная сигнализация активирует повышение медиаторов воспаления – про-воспалительных факторов: IL-1 α и IL-1 β и TNF- α , и противовоспалительных факторов: IFN- γ , IL-6, HLA-DR, что в свою очередь снижает плотность бокаловидных клеток конъюнктивы и выработку муцина – действующего строительного компонента водно-муцинового

слоя слезной пленки, вызывая стойкую хронизацию процесса [19–21].

Из-за многофакторной природы воспаления глазной поверхности необходимо оценивать качественный клеточный состав на предмет изменений в экспрессии генов или белков, чтобы выявить первопричинность патологического состояния и потенциально классифицировать результаты, полученные в ходе взятия мазка-отпечатка с бульбарной конъюнктивы, по этиологическим подтипам.

Исследовательская работа института биомедицинских наук Национального университета Сунь Ятсена Тайвань посвящена изучению экспрессии генов, связанных с аутофагией и с возрастной макулярной дегенерацией (ВМД) экссудативной формы. При выполнении ИЦ нижней части бульбарной конъюнктивы исследователи определили с помощью полимеразной цепной реакции уровни мРНК белков-ассоциированных генных структур, связанных с рецептором гамма-аминомасляной кислоты (GABARAPL1), и белков-ассоциированных генных структур (MAP1LC3B), связанных с процессом аутофагии, что послужило поводом доказательного критерия в диагностики ВМД экссудативной формы при взятии мазка-отпечатка с нижней части бульбарной конъюнктивы [22].

В фонде глазных исследований Хайдарабада Индии было проведено большое пилотное исследование о выявлении антигена вируса простого герпеса-1 (ВПГ-1) для диагностики герпетического кератита путем взятия мазка-отпечатка с поверхности роговицы с последующим проведением иммунопероксидазного или иммунофлуоресцентного анализа для выявления антигена ВПГ-1 с использованием поликлонального антитела к ВПГ-1. Итоги данной работы показали, что во всех случаях подтвержденного клинически диагноза герпетический кератит были обнаружены антиген ВПГ-1во всех мазках-отпечатках, взятых с поверхности роговицы [23].

Таким образом, важным достоинством метода ИЦ является простота техники выполнения и достоверность получаемого результата, осуществимые и в амбулаторных условиях клинической офтальмологии для верификации диагноза, тактики введения пациентов и контроля схемы лечения.

Заключение

Таким образом, диапазон применения импрес-сионной цитологии охватывает традиционную цитологическую оценку клеток глазной поверхности на предмет морфологического изучения, исследования молекулярных и клеточных медиаторов воспаления, оценку экспрессии генов путем определения уровней их транскриптов или белков, что характеризует данную методику как эффективный и безопасный метод диагностики в развитии как клинической, так и исследовательской офтальмологии.

Вклад авторов в работу : А.В. Дога, С.А. Борзенок, И.А. Мушкова – научное консультирование, редактирование статьи, окончательное одобрение варианта статьи для опубликования; А.Н. Каримова, М.Х. Хубе-цова, Д.С. Островский – научная идея и дизайн работы, сбор данных, написание текста, редактирование статьи; М.Р. Образцова – сбор данных, написание текста.

Participation of the authors : A.V. Doga, S.A. Borzenok, I.A. Mushkova – scientific consulting, editing of the article, final approval of the version of the article for publication; A.N. Karimova, M.Kh. Khubetsova, D.S. Ostrovskiy – scientific idea and design of the work, data collection, writing of the text, editing of the article; M.R. Obraztsova – data collection, writing of the text.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов (The authors declare no conflict of interest).