Основные методы идентификации наркотических веществ в трупной моче и определение биохимических показателей в крови при положительных исследованиях на наркотики

Адрес: 410012, г. Саратов, ул. Б. Казачья, 112.

Тел.: 89172007474.

хроматографические методы анализа, такие, как тонкослойная хроматография, спектрофотометрия, газовая хроматография и другие. Для определения наркотических веществ чаще всего используется моча, как наиболее информативный биообъект исследования.

Методы. Среди методов обнаружения наркотических веществ использовали тонкослойную хроматографию и спектрофотометрию [1, 2]. Хроматография как физико-химический процесс основана на различных скоростях движения и размывания концентрационных зон компонентов, которые движутся в потоке подвижной фазы вдоль слоя неподвижной фазы. При этом следует иметь в виду, что исследуемые вещества находятся в обеих фазах. После разделения анализируемой смеси на отдельные компоненты хроматографирование прекращают и в хроматографических зонах проводят качественное и количественное определение (детектирование). Для обнаружения бесцветных соединений чаще всего используют облучение УФ-светом, опрыскивание химическими реагентами, смачивание проявляющим раствором, капельное нанесение реагента, экстрагирование зоны вещества с сорбента для последующего исследования полученных соединений физическими и химическими методами. Идентификация компонентов проводится по свидетелям (метчикам) — известным эталонным веществам сравнения, хроматографируемым одновременно, на одной и той же пластинке, с анализируемой пробой.

Основными системами для двухмерной хроматографии наркотических веществ являются: 1) для опиатов: хлороформ — диоксан — ацетон — 25%-ный раствор аммиака (45:47.5:5:2.5), этилацетат — этанол — аммиак (9:1:0.5); 2) для амфетаминов: хлороформ — ацетон — этанол — 25%-ный раствор аммиака (20:20:3:1), толуол — этанол — триэтиламин (9:1:1) [3]. Основной качественной характеристикой тонкослойной хроматографии является величина Rf, которая представляет собой отношение расстояний, которые пройдены исследуемым веществом и подвижной фазой [4]. Для определения Rf очень важно точно установить положение фронта растворителя. При полном совпадении полученного значения с Rf известного соединения можно говорить только о возможной идентичности вещества, которую дополнительно подтверждали спектрофотометрией [5].

а                        б

Рис. 1. Система: этилацетат – этанол – 25%-ный аммиак (9:1:0,5). Реагент – реактив Марки. Объект – моча (а) Система: хлороформ – ацетон – этанол – 25%-ный аммиак (20:20:3:1). Реагент – реактив Марки. Объект – моча (б)

В скрининге наркотических веществ используются следующие реагенты для обнаружения: 1) раствор нингидрина, 2) реактив Драгендорфа, 3) реактив Манделина, 4) реактив Марки, 5) реактив Фреде; 6) 1 %-ный раствор Черного прочного К (FBK). Помимо производных амфетамина FBK дает различные окрашивания (красного, синего, оранжевого, фиолетового цвета) с некоторыми другими веществами (табл. 1, рис. 1–3).

На рисунках 1–3 представлены пластинки «Сорб-фил» с нанесенными на них объектами и метчиками

Таблица 1

Сравнительные значения Rf наркотических веществ на пластинках «Сорбфил»

Вещества (нарк.)	Вид систем
	основная система	Rf	основная система	Rf	основная система	Rf	основная система	Rf
Морфин	Этилацетат – этанол – 25% аммиак (9:1:0.5)	0.2	Хлороформ – диоксан – ацетон – 25% аммиака (45:47.5:5:2.5)	0.17	-	-	-	-
Кодеин	Этилацетат – этанол – 25% аммиак (9:1:0.5)	0.34	Хлороформ – диоксан – ацетон – 25% аммиака (45:47.5:5:2.5)	0.41	-	-	-	-
Промедол	Этилацетат – этанол – 25% аммиак (9:1:0.5)	0.69	Хлороформ – диоксан – ацетон – 25% аммиака (45:47.5:5:2.5)	0.72	-	-	-	-
Героин	Этилацетат – этанол – 25% аммиак (9:1:0.5)	0.60	Хлороформ – диоксан – ацетон – 25% аммиака (45:47.5:5:2.5)	0.48	-	-	-	-
МДА	Хлороформ	0.66	Толуол –	0.46	Метанол –	0.41	Этилацетат –	0.62
МДМА МДЕА	– ацетон – этанол –	0.23 0.46	этанол – триэтиламин	0.46 0.64	конц. аммиак (100:1.5)	0.31	метанол – конц. аммиак	0.62
ДОМ/STP ПМА ДМА ТМА ДОБ ДОХ МБДБ БДБ ДОЭТ Мескалин Метамфетамин	25% водный раствор аммиака (20: 20:3:1)	0.46 0.64 0.54 0.43 0.41 0.60 0.41 0.74 0.52 0.5 0.38	(9:1:1)	0.43 0.36 0.42 0.30 0.40 0.43 0.62 0.59 0.40 0.12 0.46		0.35 0.41 0.37 0.37 0.36 0.44 0.33	(85:10:5)	0.63 0.62 0.65 0.62 0.61 0.66 0.63

а

Рис. 2. Система: хлороформ – диоксан – ацетон – 25%-ный аммиак (45:47,5: 5:2,5).

Реагент – реактив Драгендорф. Объект – моча (а) Система: метанол – конц. аммиак (100:1,5) Реагент – 1%-ный раствор Черного прочного, 1М раствор едкого натра.Объект – моча (б)

б

Рис. 3. Система: этилацетат – метанол – конц. аммиак (85:10:5). Реагент – 1%-ный раствор Черного прочного, 1М раствор едкого натра. Объект – моча

после прогонки в основных камерах и опрыскивания реагентами

В основе количественных определений спектральными методами лежит закон Бугера — Ламберта — Бера, устанавливающий зависимость между оптической плотностью и концентрацией анализируемого раствора (табл. 2).

В работе использовались биохимические методики.

Определение ацетилхолинэстеразы (АХЭ) по методу Хестрина.

В пробирку помещали 1,5 мл фосфатного буфера с pH 7,6 по УИБ, 0,5 мл дистиллированной воды, 1 мл исследуемой крови в разведении 1:8 и 1 мл 0,4%-ного раствора ацетилхолинохлорида. Смесь термостатировали при периодическом встряхивании в течение 30 мин. Затем в пробирку добавляли 1 мл 25%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, через 10 мин. содержимое пробирки отфильтровывали. К 1 мл безбелкового фильтрата добавляли 2 мл смеси растворов из 3,5н едкого натра и 2н солянокислого гидроксиламина в соотношении 1:1, 1 мл соляной кислоты в разведении 1:2, 1 мл 0,37м раствора хлорного железа в 0,1н растворе соляной кислоты. Раствор колориметрировали на КФК-3 при длине волны 510 нм, в кювете толщиной слоя 5,05 мм. В качестве раствора сравнения использовали контроль на реактивы. Концентрация неразрушенного ацетилхолинохлорида в растворе имеет линейную обратно пропорциональную зависимость от активности ацетилхолинэстеразы. Кроме того, проводили определение концентрации гемоглобина. В пробирку отмеряли 2 мл трансформирующего раствора из набора «Диахим-Гемциан», добавляли 0,2 мл разведенной крови 1:8, инкубировали при температуре 20˚С 15 мин. Центрифугировали 10 мин. при 15 тыс. об/мин. Затем снимали оптическую плотность на КФК-3 при длине волны 540 нм в кювете толщиной слоя 5,05 мм. В качестве раствора сравнения использовали контроль на реактивы.

Таблица 2

Спектральные характеристики наркотических веществ

Вещество	Растворитель	λ макс, нм
Морфин	н НСl 0.1 н NaOH	285 205,298
	Этанол	286
Кодеин	н НСl	211,285
	0.1 н NaOH	284
Кодеина фосфат	Вода	284
Тебаин	0.1 н НСl 0.1 н NaOH	284 284
	0.1 н НСl	278
Героин	0.1 н Н2SO4	279
	Этанол	281
	0.1 н NaOH	278
Амфетамины: МДА		286
МДМА		286
МДЕА		286
ДОЭТ МБДБ	Водный раствор	289
		286
ПМА		275
ДОБ		295
Мескалина сульфат		268

Активность холинэстеразы прямо пропорциональна концентрации гемоглобина.

Расчет проводили по формулам:

Qon=

E 8-8 100—— .юо

E

V cm

(1),

где 8 — постоянная;

8 — разведение крови;

E

100--^100–% разрушенного ацетилхолинохлорида;

cm

E_оп — оптическая плотность опытного образца;

E_ст — оптическая плотность стандартного раствора;

E_Hb — оптическая плотность гемоглобина.

После математических преобразований формула

• (1)    принимает вид линейной зависимости: Q on = 64 — E on ∙ F ,

где F = ⁶⁴/E нь .

Определяем оптические плотности E_оп и E_ст .

СHb=F2∙EHb, где F2=64.74,

(2),

Определяем оптическую плотность Е_Нb , Q =         -331 ^Нb

Cbb+10,7

% отклонения = 100—Q'100 отклонения

Определение мочевины в крови основано на измерении скорости образования окрашенного комплекса мочевины с диацетилмонооксимом в сильнокислой среде в присутствии тиосемикарбазида и ионов трехвалентного железа.

0,5 мл крови с 4,5 мл 5%-ного раствора трихлоруксусной кислоты центрифугировали 5 мин при 3000 об/мин. К 0,02 мл полученной надосадочной жидкости добавляли 2 мл реактива, полученного путем смешивания равных количеств 0,9 н серной кислоты и реактива на мочевину (диатилмонооксим 5 ммоль/л, тиосемикарбазид 0,08 ммоль/л и трехвалентное железо 25 ммоль/л). В качестве контроля раствор мочевины с концентрацией 16,65 ммоль/л. Растворы ставили на кипящую водяную баню на 10 мин. Реакционная смесь дает с мочевиной розовое окрашивание. Концентрация мочевины прямо пропорциональна его оптической плотности и рассчитывается по формуле: C = F • E on , F = ¹⁶-⁶⁵/E_cm . Раствор колориметрировали на КФК-3, кювета 5,05 мм, длина волны 500 нм, определяли оптическую плотность и концентрацию мочевины.

Определение креатинина крови основано на измерении скорости образования окрашенного комплекса креатинина с пикриновой кислотой в щелочной среде.

0,5 мл крови добавляли 0,5 мл трихлоруксусной кислоты с концентрацией 1,22 ммоль/л, 1 мл дистиллированной воды, центрифугировали 5 мин при 3000 об/мин. К 1 мл надосадочной жидкости добавляли 0,5 мл пикриновой кислоты с концентрацией 0,04 ммоль/л и 0,5 мл едкого натра с концентрацией 0,75 ммоль/л, перемешивали и оставляли на 20 мин при комнатной температуре. В качестве контроля использовали раствор, со- стоящий из смеси креатинина 445,2 мкмоль/л и альбумина 20 г/л. Раствор сравнения — водный раствор пикриновой кислоты. Реакционная смесь дает с креатинином желто-оранжевое окрашивание. Концентрация креатинина прямо пропорциональна его оптической плотности и рассчитывается по формуле: C=FEon, F=0,177/Ecm. Раствор колориметрировался на КФК-3, кювета 5,05 мм, при длине волны 500 нм, измеряли оптическую плотность и концентрацию креатинина.

Результаты. Проведенный анализ десяти исследований трупной крови при положительных реакциях на наркотические вещества выявил следующее: 1) показатели ацетилхолинэстеразы в пяти случаях были в пределах нормы (292–334 ExhHb), в трех случаях были понижены на 2, 5 и 28% и в двух случаях повышены на 5 и 17%; 2) показатели мочевины в трех случаях укладывались в границы нормы (3,0-5,0 ммоль/л), в двух случаях были ниже нормы, а в пяти случаях повышены; 3) показатели креатинина в двух случаях были в пределах нормы (0,12–0,26 ммоль/л), в трех случаях понижены, а в пяти случаях повышены (табл. 3).

Таблица 3 Соотношения биохимических показателей в трупной крови при положительных исследованиях на наркотические вещества и в контроле

(3),

Биохимический показатель	Контроль	Исследуемая группа
	(М±m)	(М±m)	Р
АХЭ	312±22	338±24	Р>0,05
Креатинин	0,19±0,07	0,22±0,08	Р>0,05
Мочевина	4±0,87	7,5±0.8	Р<0,05

В качестве контроля брали трупную кровь при отрицательных результатах исследования на наркотические вещества. Из табл. 3 видно, что биохимические показатели ацетилхолинэстеразы и креатинин не являются достоверными величинами и находятся в интервале Р>0,05. В то же время концентрация мочевины в трупной крови потребителей наркотиков была выше по сравнению с кон-ролем (Р<0,05).

Обсуждение . Проведенное исследование позволяет говорить о несовпадении результатов биохимических исследований крови при наличии наркотических веществ и их дериватов в моче наркотизирующихся, несовершенстве имеющихся на сегодняшний день методов биохимического подтверждения потребления наркотических препаратов. Полученные результаты стимулируют поиск информативных биохимических маркеров при положительных исследованиях трупной крови на наркотические вещества.

Выводы:

• 1.    Какой-либо зависимости между показателями ацетилхолинэстеразы и креатинина в трупной крови при положительных исследованиях на наркотические вещества не выявлено. Обнаружено увеличение концентрации мочевины в трупной крови потребителей наркотиков.

• 2.    Целесообразно продолжить поиск информативных биохимических маркеров при положительных исследованиях трупной крови на наркотические вещества.