Особенность экспрессии каспазы-3 в гиппокампе при моделировании острого эпилептического припадка

Демяшкин Г.А., Шаповалова Е.Ю., Григорян М.С., Зорин И.А. Особенность экспрессии каспазы-3 в гиппокампе при моделировании острого эпилептического припадка. Морфологические ведомости. 2023;31(2):801. (2).801

Demyashkin GA, Shapovalova EY, Grigoryan MS, Zorin IA. Features of the сaspase-3 expression in the hippocampus at the modelling of the experimental acute epileptic fit. Morfologicheskie Vedomosti – Morphological newsletter. 2023;31(2):801. (2).801

Введение. Эпилепсия является одной из наиболее распространенных неврологических патологий. Несмотря на длительное изучение эпилепсии и эпилептических припадков нейробиологиче-ский субстрат заболевания до сих пор остается малоизученным [1-4]. В настоящее время согласно протоколу Международной лиги по борьбе с эпилепсией (ILAE) склероз гиппокампа (мезиальный височный склероз) характеризуется потерей нейронов и глиозом и в котором выделяют 3 формы: типичная (I тип) и атипичная (II-III типы) [5]. Тем не менее, на сегодня остается неясным, является ли склероз гиппокампа причиной или следствием эпилепсии и эпилептических припадков [1, 6]. Для изучения эпилептогенеза и нейробиологического субстрата широко применяется экспериментальный метод моделирования эпилептических припадков. В большинстве работ отмечалось, что в эксперименте у животных обнаруживаются признаки повреждения гиппокампа, характерные для пациентов с эпилепсией [710]. Однако вопрос о механизмах нейронального повреждения до сих пор остается открытым. В ряде немногочисленных исследований было показано, что у экспериментальных животных после приступа эпилепсии отмечается повышение уровня некоторых каспаз в нейронах [11-12]. Такие данные позволяют предположить, что нарушение местного гомеостаза запускает апоптотический каскад, который приводит к гибели нейронов. Известно, что в головном мозге инициация апоптоза происходит через каспазы-8, -9, -10, которые активируют терминальные каспазы -3, -6, -7 [13-14]. Имеющихся данных недостаточно для полного представления о природе каспазного каскада при эпилепсии, и, особенно, его терминальной фазы. Особого интереса заслуживает анализ патоморфо-логических изменений структур гиппокампа на фоне острого эпилептического припадка в корреляции между нейрональной потерей и терминальной фазой апоптоза и количественная оценка активности каспазы-3 в связи с этим.

Цель исследования - иммуногистохимическая оценка экспрессии каспазы-3 в гиппокампе в экспериментальной модели эпилепсии на лабораторных мышах.

Материалы и методы исследования. Экспериментальное морфологическое исследование проводили в лабораториях Медицинской академии имени С.И. Георгиевского Крымского федерального университета имени В.И. Вернадского (Симферополь) и Институте трансляционной медицины и биотехнологии Первого Московского государственного медицинского университета имени И.М. Сеченова (Москва). В качестве животных моделей использовали самцов половозрелых мышей популяции CBA (весом 30-35 грамм, 12-ти недель жизни, n=30). Все манипуляции осуществляли согласно международным рекомендациям и руководствам по проведению медикобиологических исследований по уходу и использованию лабораторных животных (ILAR, DELS) и Правилам лабораторной практики и приказа Министерства здравоохранения РФ № 199-н от 01.04.2016 «Об утверждении правил лабораторной практики». Животные были поделены на группы: I-я (n=28) - моделирование острого приступа эпилепсии, который оценивался по модифицированной шкале Расина [10]; II-я группа (n=20) - контрольная. Для моделирования острого генерализованного приступа эпилепсии животным вводили эпилептогенный препарат пен-тилентетразол интраперитонеально, однократно, в дозе 45 мкг/ кг. Животных I-й и II-й группы выводили из эксперимента через 3 часа и последовательно на 1, 3 и 5 сутки от начала введения препарата для динамического исследования изменений в гиппокампе. Выведение животных из эксперимента осуществляли путем введения высоких доз анестетика. Для оценки морфологического субстрата эпилепсии при исследовании гиппокампа экспериментальных животных изучали субрегионы СА1, СА3 и область зубчатой извилины. Фрагменты головного мозга фиксировали в 10% нейтральном формалине, забуфе-ренном по Лилли при рН 7,2-7,4, затем заливали в парафин. После депарафинизации и регидратации парафиновых срезов их окрашивали по Нисслю. Иммуногистохимическое исследование проводили по стандартному протоколу в автоматическом режиме в иммуногистостейнере Bond-Max (Leica, Германия). Использовались первичные мышиные моноклональные антитела к Caspase 3 (3CSP03; 0,1 мл) и вторичные – универсальные антитела (HiDef Detection™ HRP Polymer system, Cell Marque, США). Количество иммуно-позитивных клеток подсчитывали в 10 полях зрения препарата гиппокампа при увеличении х400. Для проверки выборки полученных данных на нормальность распределения использовали Критерий Шапиро–Уилка. Для проверки различий значений использовали t-критерий Стьюдента. Статистически значимыми считали результаты при p<0,05.

Результаты исследования и обсуждение. У всех животных I группы отмечали генерализованный эпилептический припадок, который, согласно модифицированной шкале Расина, соответствовал 4 (n=14), 5 (n=11) и 3 (n=3) баллам. Среднее время приступа составило 5,19±0,7 минут. В контрольной группе после интраперитонеальной инъекции физиологического раствора у животных не обнаружили судорожной активности, их поведение оценили на –1 балл по шкале Расина. После развития эпилептического приступа у всех животных не наблюдали признаков нарушения гемодинамики и расстройства поведенческих реакций. При гистологическом исследовании микропрепаратов гиппокампа опытной группы, окрашенных по Нисслю, через 3 часа после интраперитонеальной инъекции пентилентетразола нарушения его гистоархитектоники не обнаружили. Через 24 часа у животных опытной группы визу- ализировали дезинтеграцию темных нейронов с признаками пикноза и трудно различимыми границами между цитоплазмой и ядром (рис. 1). В динамике на 3 и 5 сутки отмечали тенденцию к уменьшению количества патологических нейронов.

Рис. 1. Микрофото гистологического препарата головного мозга мыши экспериментальной группы. Окр.: по Нисс-лю. Ув.: х200

В контрольной группе наблюдали нормальное гистологическое строение вещества головного мозга и зоны гиппокампа. При исследовании уровня каспазы-3 в субрегионе CA3 через 24 часа после моделирования острого эпилептического припадка также наблюдали увеличение положительно окрашенных пирамидальных нейронов гиппокампа в 2,68 раза (рис. 2) по сравнению с контрольной группой (таблица 1). В других временных точках количество иммунопозитивных клеток статистически значимо не отличалось от контрольных значений.

Таблица 1

Относительное количество нейронов в % экспрессирующих каспазу-3 в субрегионе СА3 гиппокампа мыши при моделировании эпилептического припадка (M ± a)

Настоящее исследование посвящено изучению молекулярных механизмов клеточной гибели нейронов гиппокампа при остром генерализованном приступе эпилепсии, вызванного пентилентетразо-лом у мышей линии СВА. Для оценки эффекта острого эпилептического припадка (появление мезиального склероза) мы использовали окраску по Нисслю, позволяющую обнаружить темные нейроны, роль которых в настоящее время до конца не изучена. Раньше предполагалось, что их количество прямо пропорционально степени повреждения головного мозга, однако, на сегодня такая корреляция подвергается сомнению [15–17].

А

Б

Рис. 2. Микрофото гистологических препаратов головного мозга мыши экспериментальной (А) и контрольной (Б) групп СА3 региона гиппокампа через 24 часа после инъекции. Окр.: иммуногистохимическая с антителами к каспазе-3, докрашивание гематоксилином. Ув.: х400

Иммуногистохимическое исследование уровня активированной каспазы-3 показало, что через 24 часа после введения препарата пентилентетразола наблюдается наибольшее количество нейронов, экспрессирующих каспазу-3. Как известно, каспаза-3 является терминальной сигнальной молекулой в каспазном каскаде, инициирующем апоптоз. Принято считать, что при эпилептических припадках активация каспазы-3 происходит в ответ на повреждение и фрагментацию молекул ДНК в пирамидных нейронах, преимущественно СА1-СА3 региона гиппокампа [18-19]. Более того, существуют исследования, в которых ингибирование каспазы-3 приводило к увеличению количества выживших клеток после генерации эпилептического припадка [20]. Результаты настоящего исследования согласуются с устоявшимися представлениями о роли каспазы-3 в регуляции апоптоза, так как наибольшая экспрессия каспазы-3 ассоциируется с максимальной клеточной гибелью [21]. Особо стоит отметить, что уже на 5-е сутки гистоархитектоника гиппокампа соответствует норме. Та- кое быстрое восстановление не исключает того явления, что каспаза-3 в гиппокампе может регулировать не только терминальную стадию апоптоза, но и участвовать в ремоделировании синапсов и цитоскелета, клеточной дифференцировке и реинтеграции нейритов, необходимых для нейропластичности, как было показано в единичных исследованиях [22].

Заключение. Таким образом, суммируя полученные данные, можно отметить, что однократная инъекция пентилен-тетразола вызывает генерализованный эпилептический припадок, ассоциированный с увеличением экспрессии каспаза-3 при нейрональной гибели. В дальнейшем необходимо продолжить изучение роли каспазы-3 в этом явлении, так как, возможно, она не ограничивается лишь апоптоти-ческим действием. Потеря нейронов гиппокампа субрегиона CA3 ассоциирована с увеличением экспрессии каспазы-3 через 24 часа после моделирования острого генерализованного припадка с помощью инъекции пентилентетразола.