Особенности амплификации генов CCND1 и EGFR и их соответствие с экспрессией белков CYCLIN D1 и EGFR при плоскоклеточном раке языка

doi:

ORIGINAL ARTICLE doi:

Ежегодно в мире умирает 145 тыс. больных со злокачественными новообразованиями ротовой полости, а диагностируются 830 тыс. новых случаев [1, 2]. Протоонкоген CCND1 принимает участие в прогрессии опухоли и может применяться как прогностический маркер, а его амплификация способствует неблагоприятному клиническому исходу заболевания [3]. Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) играет важную роль в канцерогенезе плоскоклеточного рака полости рта. Изменение числа копий гена является одним из механизмов увеличения экспрессии белка EGFR, и связано с метастатическим поражением лимфатических узлов, инвазивным ростом опухоли и периневральной инвазией, глубиной опухолевой инвазии, стадией опухоли. Опухолевые клетки с амплификацией EGFR обладают большой способностью к инвазии [4].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Провести оценку количества опухолевых клеток с амплификацией генов CCND1 и EGFR и ее соответствие с экспрессией белков Cyclin D1 and EGFR при плоскоклеточном раке языка.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Были изучены 19 наблюдений плоскоклеточного рака языка, полученных в радиологическом отделении Медицинского радиологического научного центра им. А. Ф. Цыба в период с 2018

по 2020 г. Возраст пациентов составил от 27 до 89 лет (средний возраст 56,7 ± 11). Материал 12 наблюдений (64 %) принадлежал лицам мужского пола и 7 наблюдений (36 %) женщинам. Цитогенетически изучались мазки опухолевой ткани рака языка. В качестве «внутреннего контроля» исследовали образцы контралатеральной интактной слизистой оболочки языка этих же пациентов. Предметные стекла с нанесенными на них мазками помещали в фиксатор (смесь метанола и уксусной кислоты в соотношении 3 : 1).

Исследование выполнено методом интерфазной флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с применением коммерческих ДНК-зондов ген/центромера хромосомы: EGFR/CEP7 и CCND1/ CEP11 (Kreatech, Нидерланды). Денатурацию ДНК проводили в автоматической камере Hybrite при 74 °С в течение 7 минут. Гибридизацию осуществляли при 37 °С в термостате в течение 18 часов. Для визуализации препаратов наносили DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол). Анализ цитогенетических нарушений выполнялся на флуоресцентном микроскопе AxioImager (Zeiss). В каждом наблюдении анализировали по 100-230 клеток и оценивали количество клеток опухоли с амплификацией генов CCND1, EGFR. Для гистологического исследования во всех случаях использовался биопсийный материал опухоли.

В соответствии с критериями классификации ВОЗ наблюдения были разделены на высо- кодифференцированные (G1), умереннодифференцированные (G2) и низкодифференцированные (G3) плоскоклеточные раки. В соответствии с TNM классификацией наблюдения были разделены на T1, T2, T3, T4. Для иммуногистохимического исследования использовались антитела к Cyclin D1 (клон AM29, Zymed Laboratories, разведение 1 : 50) и к EGFR (Novocastra, разведение 1 : 20). Для уточнения связи между количеством опухолевых клеток с амплификацией EGFR и CCND1 использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Сформулированы нулевая (Н0) и альтернативная (Н1) гипотеза: Н0 – корреляции между переменными не отличаются от нуля; Н1 – корреляции между переменными отличаются от нуля. Статистические гипотезы проверяли на уровне значимости α = 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Цитогенетическое исследование

При изучении амплификации гена EGFR исследовано 3 440 опухолевых клеток и 3 066 клеток – при изучении амплификации гена CCND1. Во внутреннем контроле исследовано 900 клеток (табл. 1)

Таблица 1

Результаты цитогенетического исследования количества клеток с амплификацией EGFR и CCND1 в ткани опухоли и контрольной (контралатеральной) стороне языка

Ген/центромера	Группа	Количество исследованных клеток	Медиана клеток с амплификацией
EGFR/CEP7	«Внутренний контроль»	900	1
	Опухоль	3440	9
CCND1/CEP11	«Внутренний контроль»	900	1
	Опухоль	3066	13

В опухолевых клетках всех образцов выявлена амплификация генов EGFR и CCND1. Количество клеток с амплификацией изучаемых генов занимала широкий диапазон. Так, для гена EGFR она составила от 1 до 59 клеток, а для гена CCND1 составила от 1 до 87 клеток. Из таблицы следует, что медиана клеток с амплифика- цией генов EGFR и CCND1 в опухоли превышает показатели контралатеральной интактной стороны языка. В 100 % наблюдений амплификация EGFR и CCND1 сочетались. Количество опухолевых клеток с амплификацией EGFR, CCND1 и соответствующие им категории Т и степени дифференцировки показаны в табл. 2.

Таблица 2

Результаты цитогенетического исследования количества клеток с амплификацией EGFR и CCND1 в ткани опухоли в зависимости от категории Т и степени опухолевой дифференцировки

Категория опухоли Т	Степень дифференцировки	Количество опухолевых клеток	Количество опухолевых клеток
		с увеличением копий EGFR	с увеличением копий CCND1
Т1	G1	6	6
Т1	G1	29	87
Т1	G1	5	1
Т2	G1	31	53
Т2	G2	14	23
Т2	G2	12	38
Т2	G1	20	13
Т2	G3	1	6
Т2	G1	59	51
Т2	G1	3	12
Т2	G1	3	26
Т2	G2	2	7
Т2	G1	42	6
Т2	G2	1	3
Т3	G2	3	10
Т3	G3	5	52
Т3	G2	16	18
Т3	G1	2	12
T4	G1	22	14

В наблюдениях разных категорий и дифференцировки определялось как небольшое, так и увеличенное количество клеток с амплификации EGFR и CCND1 (рис. 1, 2).

При проведении корреляционного анализа между категорией опухоли Т и количеством опухолевых клеток с увеличением копий EGFR значимых различий не получено ( p = 0,46).

При проведении корреляционного анализа между категорией опухоли Т и количеством опухолевых клеток с увеличением копий CCND1 значимых различий не получено ( p = 0,46).

При проведении корреляционного анализа между степенью опухолевой дифференцировки и количеством опухолевых клеток с увеличением копий EGFR значимых различий не получено ( p = 0,46).

При проведении корреляционного анализа между степенью опухолевой дифференцировки и количеством опухолевых клеток с увеличением копий CCND1 значимых различий не получено ( p = 0,46).

Во всех 19 исследуемых наблюдениях проведено дополнительное параллельное иммуногистохимическое исследование по выявлению экспрессии белков EGFR и Cyclin D1 соответственно, при этом диффузная, преимущественно умеренная экспрессия EGFR определялась в 17 (89 %) из 19 наблюдений (рис. 3), очаговая слабая экспрессия – в двух наблюдениях (11 %).

Экспрессия Cyclin D1 всех анализируемых наблюдений была очаговой, слабой и умеренной (рис. 4).

Рис. 1. Опухолевая клетка плоскоклеточного рака языка с амплификацией гена CCND1 (красные сигналы)

Рис. 2. Опухолевая клетка плоскоклеточного рака языка с амплификацией гена EGFR (4 красных сигнала)

Рис. 3. Диффузная экспрессия EGFR в клетках плоскоклеточного рака языка.

ИГХ окрашивание, ×100

Рис. 4. Очаговая слабая и умеренная экспрессия Cyclin D1 в клетках плоскоклеточного рака языка.

ИГХ окрашивание, ×400

Рецептор EGFR в опухолевых клетках способствуют пролиферации, инвазии и метастазированию, а его гиперэкспрессию часто связывают с неблагоприятным исходом заболевания при опухолях головы и шеи [5]. Амплификация гена EGFR в нашем исследовании определялась в 100 % наблюдений, однако выявлялась в различном количестве опухолевых клеток как при начальных категориях опухоли и высокой степени дифференцировки, так и при более поздних категориях опухоли и низкой степени дифференцировки. При категориях Т1 и T4 встречались наблюдения с количеством клеток, незначительно отличающихся друг от друга. Таким образом, мы не обнаружили связь между категорией опухоли и степенью дифференцировки с количеством опухолевых клеток с амплификацией EGFR. По данным исследователей, частота амплификации гена EGFR при плоскоклеточном раке полости рта составляет от 17-31 %, однако количество клеток с амплификацией данного гена не изучалось [6]. Исследователи отмечают более частое выявление амплификации гена EGFR при плоскоклеточном раке полости рта поздних стадий, чем ранних [7].

По данным других исследователей, низкодифференцированные опухоли чаще встречались на поздних стадиях заболевания (T3-T4), однако характеризовались амплификацией EGFR, как и в высокодифференцированных опухолях [8]. Это несоответствие может указывать на то, что амплификация EGFR оказывает неопределенное влияние на поведение плоскоклеточного рака ротовой полости [9].

В нашем исследовании в 100 % наблюдений с амплификацией гена EGFR выявлена экспрессия белка EGFR, однако в 89 % экспрессия была сильной, а в 11 % наблюдений – умеренной. Исследователями также в 100 % наблюдений рака языка выявлено соответствие