Особенности функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов у детей с острым лимфобластным лейкозом

Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) является самой распространенной опухолью кроветворной ткани в детском возрасте и составляет 25–30 % всех злокачественных опухолей у детей и 80–90 % случаев острого лейкоза. Современные возможности терапии позволили существенно изменить прогноз у детей с ОЛЛ, 5-летняя без-рецидивная выживаемость составляет от 70 до 84 % [5, 11].

Несмотря на совершенствование цитостатической и сопроводительной терапии, инфекционные осложнения на сегодняшний день являются ведущей причиной смертности, не обусловленной прогрессированием основного заболевания [9]. Факторами, определяющими высокий риск инфекционных заболеваний и связанной с ними смертности, являются и особенности патофизиологии заболевания, и повреждения эпителиальных барьеров, и необходимость проведения инвазивных диагностических и лечебных процедур, и побочные действия, и осложнения химиотерапии. Помимо индукции апоптоза в клетках-мишенях, цитостатики вызывают выраженный миелотоксический эффект. Кроме количественных изменений, обусловленных как проявлениями заболевания, так и осложнениями проводимой терапии, нейтрофилы крови больных с гемобластозами имеют и функциональные дефекты уже на начальном этапе лечения. Цитостатики, глюкокортикоиды, лучевая терапия приводят к резкому усилению дисфункции фагоцитов [10].

Количественные и качественные дефекты всех звеньев иммунитета, в том числе нейтрофильного звена, являются основой развития и тяжелого и нетипичного течения инфекционных процессов у больных с острым лимфобластным лейкозом. Нейтрофилы являются фактором поддержания гомеостаза и составляют первую линию неспецифической противомикробной защиты организма. Одной из основных функций нейтрофилов является элиминация чужеродных агентов, которая реализуется с развитием так называемого респираторного взрыва [4]. Резуль- татом каскада биохимических реакций является продукция активных форм кислорода (АФК), обладающих бактерицидным действием. Именно на регистрации интенсивности респираторного взрыва основан хемилюминесцентный анализ [1]. Наибольший вклад в продукцию активных форм кислорода определяется, прежде всего, нейтрофилами. В качестве неспецифического индуктора в хемилюминесцентной реакции применяется зимозан – полисахарид, получаемый из культуры Saccharomyces cerevisiae. Учитывая зависимость между уровнем хемилюминесценции фагоцитов и киллингом, результаты, полученные при использовании данного метода, могут характеризовать способность гранулоцитов к завершенному фагоцитозу [2].

Таким образом, целью данного исследования явилась оценка функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов детей с острым лимфобластным лейкозом методом люминол-зависимой хемилюминесценции цельной крови.

Материал и методы

Под наблюдением находились 47 больных острым лимфобластным лейкозом в возрасте от 1 года до 17 лет 11 мес 29 дней. Возрастная структура наблюдаемых пациентов: от 1 до 3 лет – 7 больных; от 3 до 7 лет – 20; от 7 до 11 лет – 7; от 11 до 15 лет – 7; от 15 до 17 – 6 пациентов. Диагноз острого лимфобластного лейкоза устанавливался на основании клинических проявлений, морфологического, цитохимического исследования мазков костного мозга, иммунофенотипирования бластных клеток. Все дети получали интенсивную программную полихимиотерапию по протоколам ALL BFM95m и MB-2002 [6]. Группу контроля составили 30 детей в возрасте от 1 до 18 лет I–II группы здоровья, которые не имели острых заболеваний и проявлений аллергических реакций в момент исследования.

Функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов оценивали методом люминол-зависимой хемилюминесценции. Учитывая, что хемилюминесцентный ответ крови определяется в основном фагоцитирующими клетками, способными продуцировать АФК, и присутствие неадгезирующих клеток не оказывает существенного влияния на характер развития хемилюминесцентного ответа, нейтрофильные гранулоциты из крови не выделяли, исследование проводили в цельной гепаринизированной крови [7].

Функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов методом хемилюминесцентного анализа исследовали при развитии инфекционных осложнений на фоне индуцированной химиотерапией гипоплазии кроветворения. Оценка спонтанной и индуцированной хемилюминесценции производилась в течение 90 мин на 36-канальном хемилюминесцентном анализаторе «СL3604» (Россия). Регистрация результатов и управление анализатором осуществлялись через персональный компьютер. В качестве индуктора дыхательного «взрыва» использовался опсонизированный зимозан. Определялись следующие характеристики: время выхода кривой на максимум (Tmax), максимальная интенсивность свечения (Imax), светоплощадь свечения (S) при спонтанной и индуцированной хемилюминесценции, а также индексы активации, демонстрирующие усиление хемилюминесценции, индуцированной зимозаном, относительно спонтанной – соотношения Imax инд. /Imax спон., S инд./S спон.

Статистическая обработка проводилась с использованием методов непараметрического анализа пакета прикладных программ Statistica for Windows, Release 7.0 «StatSoft Inc». Проверку достоверности гипотез относительно изучаемых показателей проводили с помощью критерия Манна–Уитни для двух независимых выборок. Различия между группами считались статистически значимыми при р<0,05. Данные представлены в виде значений медианы и 25-го и 75-го квартилей.

Результаты и обсуждение

В период миелотоксических осложнений у всех наблюдаемых больных количество гранулоцитов не превышало 0,5×109/л. Среди исследуемых пациентов наблюдались следующие инфекционные осложнения: мукозит ротовой полости – у 15 больных, фебрильная нейтропения – у 9, энтероколит – у 8, фарингиты – у 7, бронхиты – у 6, пневмония – у 1, инфильтрат мягких тканей – у 1 больного. Все больные получали антибактериальную терапию и препараты гранулоцитарного колониестимулирующего фактора.

При анализе полученных данных выявлено,

Таблица 1

Показатели хемилюминесценции цельной крови детей с ОЛЛ на фоне нейтропенических инфекционных осложнений (Me (C25;C 75))

Показатель Контроль (n=30) Больные ОЛЛ (n=47) р 1 2 Tmax спон., сек 3340 (1605; 4296) 2921 (1475; 4168) Imax спон., о.е. 99 (86; 110) 147 (107; 227) р1,2<0,01 S спон., о.е. ×104 0,47 (0,44; 0,55) 1,37 (0,85; 2,38) р1,2<0,01 Tmax инд., сек 1601 (1483; 1748) 1684 (1248; 1983) Imax инд., о.е. 748 (457; 1090) 246 (162; 516) р1,2<0,01 S инд., о.е. ×104 2,78 (2,02; 3,56) 2,48 (1,22; 4,80) Imax инд./Imax спон. 8,28 (4,4; 11,32) 1,74 (1,24; 2,69) р1,2<0,01 Sинд./S спон. 6,31 (3,39; 8,33) 1,49 (1,16; 2,22) р1,2<0,01 что время выхода хемилюминесцентной кривой на максимум статистически значимо не различалось при сравнении с группой контроля (табл. 1). Следовательно, наличие инфекционных осложнений у больных ОЛЛ не способствует более быстрой активации нейтрофилов.

При оценке уровня максимальной интенсивности свечения (Imax) у больных ОЛЛ отмечено статистически значимое повышение Imax при спонтанной и индуцированной хемилюминесценции. Можно предположить, что данный факт связан с тем, что лейкоциты у детей с ОЛЛ были активированы вследствие имеющихся инфекционных осложнений, что и нашло отражение при определении показателей их функции. Подобные результаты получены А.Е. Кратновым и Е.В. Борисовой (2007) при определении активности миелопероксидазы, играющей ключевую роль в образовании ряда АФК в нейтрофилах детей с ОЛЛ: у детей, получающих программную интенсивную химиотерапию, активность миелопероксидазы в нейтрофилах была выше, чем в группе контроля [3].

При анализе показателей светоплощади хемилюминесценции отмечается статистически значимое повышение данного показателя при спонтанной хемилюминесценции (Sспон.) у больных с ОЛЛ по сравнению с контролем. После воздействия зимозана уровень светопло-щади хемилюминесценции у больных с ОЛЛ значимо не отличался от уровня данного показателя, регистрируемого в группе контроля.

Соотношение Imax инд./Imax спон. демонстрирует усиление хемилюминесценции в от- СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2011. №2 (44)

вет на воздействие индуктора «дыхательного взрыва» и отражает резерв функциональных возможностей лейкоцитов. Коэффициент Imax инд./Imax спон. у больных ОЛЛ оказался статистически значимо более низким, чем в группе контроля.

При оценке индекса активации, описываемого соотношением S инд./S спон., у больных ОЛЛ на фоне индуцированной цитопении данный коэффициент был статистически значимо меньше такового при сравнении с группой контроля. Таким образом, снижение индексов активации указывает на истощение резервных возможностей к генерации АФК в нейтрофильных гранулоцитах детей с ОЛЛ.

Учитывая, что некоторые исследователи при изучении смертности детей с ОЛЛ [8] указывают, что развитие лекарственного гепатита вследствие гепатотоксичного действия химиотерапии способствует изменению фармакокинетики цитостатиков и усилению их токсического действия на организм, мы попытались установить, как меняются в этих случаях показатели хемилюминесценции. Токсическое поражение печени у наблюдаемых больных диагностировалось по повышению уровня аминотрансфераз и/или прямой гипербилирубинемии при условии исключения гепатитов вирусной этиологии.

При сравнении изучаемых показателей в зависимости от наличия гепатотоксических осложнений (табл. 2) было выявлено, что у больных с указанными осложнениями были статистически значимо повышены показатели максимальной интенсивности свечения при

Таблица 2

Показатели хемилюминесценции цельной крови детей с ОЛЛ в зависимости от наличия токсического поражения печени (Me (C25;C 75))

Показатель Без гепатита (n=39) Токсический гепатит (n=8) р 1 2 Tmax спон., сек 2921 (1295; 4245) 2990 (2576; 3772) Imax спон., о.е. 131 (105; 218) 223 (189; 258) р1,2<0,01 S спон., о.е. ×104 1,23 (0,82; 2,24) 1,74 (1,32; 3,30) Tmax инд., сек 1534 (1248; 2264) 1836 (1484; 1919) Imax инд., о.е. 221 (162; 416) 739 (538; 1001) р1,2<0,01 Sинд., о.е. × 104 2,06 (1,15; 3,86) 5,42 (3,80;10,99) р1,2<0,01 Imax инд./Imax спон. 1,55 (1,16; 2,40) 3,23 (2,58; 4,20) р1,2<0,01 Sинд./S спон. 1,31 (1,12; 1,90) 2,8 (2,19; 3,60) р1,2<0,01 спонтанной (р<0,01) и индуцированной хемилюминесценции (р<0,01) и светоплощадь при индуцированной (р<0,01). Индексы активации Imax инд./Imax спон. и Sинд./S спон. также оказались более высокими у больных ОЛЛ при наличии токсического поражения печени (р<0,01).

Таким образом, продукция АФК в нейтрофилах была более высокой у больных с гепато-токсическими осложнениями химиотерапии. Данный факт может быть связан с тем, что цитостатики индуцируют апоптоз, используя те же пути, что и физиологические индукторы. Кроме цитотоксического действия, АФК способствуют и развитию апоптоза, стимулируя свободнорадикальные процессы в клетках и истощая ферменты антиоксидантной защиты. Возможно, что следствием более активного воздействия цитостатиков у больных ОЛЛ с явлениями гепатотоксичности, обусловленной химиотерапией, является уменьшение потенциала антиоксидантной защиты в нейтрофилах, что находит выражение в изменении их функциональной активности.

Заключение

В результате проведенного исследования выявлены особенности функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов детей с ОЛЛ, получающих программную химиотерапию. Установлено, что скорость генерации АФК в период миелосупрессии у больных ОЛЛ значимо не отличается от группы контроля. В период миелотоксических осложнений имеет место по- вышение функциональной активности нейтрофилов при оценке максимальной интенсивности свечения и светоплощади спонтанной хемилюминесценции, что, возможно, обусловлено имеющимися инфекционными осложнениями. В то же время отмечается низкий, по сравнению со здоровыми детьми, ответ на стимуляцию зимозаном, отражая сниженные функциональные резервы фагоцитов. Наличие гепатотоксических осложнений сопровождается более активным образованием АФК и, возможно, приводит к дефициту антиоксидантной защиты нейтрофилов, способствуя их апоптозу.