Особенности иммунного статуса у людей, перенесших хронический лучевой синдром, в отдалённые сроки

Хронический лучевой синдром (ХЛС) относится к группе редких патологических состояний, обусловленных длительным воздействием ионизирующей радиации на организм в дозах, превышающих пороговые значения для развития тканевых эффектов в критических по радиочувствительности системах (иммунная, кроветворная и нервная) [1]. Случаи ХЛС в нашей стране, в основном, регистрировали в период создания атомной промышленности не только у персонала, но и жителей территорий, подвергшихся аварийному радиоактивному загрязнению [2]. Так, случаи ХЛС были зарегистрированы у жителей прибрежных сёл реки Течи, которые вследствие сбросов в неё радиоактивных отходов ПО «Маяк» подверглись многолетнему комбинированному внешнему и внутреннему у -облучению. Клинические проявления ХЛС у населения бассейна реки Течи, включая особенности, обусловленные преимущественным облучением кроветворной и иммунной систем за счёт ⁹⁰Sr, описаны в ряде публикаций [1, 3, 4].

Одним из ранних клинических проявлений синдрома являются нарушения иммунитета, которые регистрировали на фоне угнетения костномозгового кроветворения, нейтропении и

Аклеев А.А.* – доц. кафедры, к.м.н. ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России, ФГБУН УНПЦ РМ ФМБА России; Долгушин И.И. – зав. кафедрой, академик РАН, профессор. ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России.

лимфоцитопении. Результаты первых исследований позволили отметить снижение показателей противоинфекционной резистентности у облучённых людей (повышение доли патогенной микрофлоры кожи и слизистых оболочек, снижение фагоцитарной активности нейтрофилов крови, лизоцима в слюне и др.). Нарушения со стороны иммунной системы сохранялись многие годы, что определялось длительным облучением красного костного мозга (ККМ) инкорпорированным в костную ткань 90Sr. Так, даже через 10-15 лет после начала облучения в условиях снижения мощности дозы облучения ККМ до 0,02-0,15 Гр/год и ниже сохранялись признаки угнетения иммунитета по тесту аутомикрофлоры кожи, хотя выраженность иммунодепрессии значительно уменьшилась. У большинства пациентов с ХЛС в это время отмечалась нормализация фагоцитарной функции нейтрофилов крови, а у 30% пациентов – её повышение, которое рассматривалось как результат восстановительных процессов. Через 20 лет после начала облучения показатели, характеризующие факторы иммунной системы, в основном, восстановились, но применение нагрузочных тестов с пирогеналом свидетельствовало о снижении их резервных возможностей [1, 5]. Функциональное состояние иммунной системы в отдалённые сроки у лиц, перенесших ХЛС, до настоящего времени остаётся мало исследованным.

Важно отметить, что при дозах, превышающих пороговые значения, причинноследственная связь между дозой облучения ККМ и развитием ХЛС прослеживалась не всегда. Степень радиационного угнетения иммуно-гемопоэза в условиях хронического облучения определялась не только дозой и мощностью дозы облучения ККМ, но и индивидуальными особенностями организма, направленными на пострадиационное восстановление кроветворения и иммунитета [1-4]. Можно полагать, что жители прибрежных сёл реки Течи, у которых развился ХЛС, обладали более высокой радиочувствительностью по сравнению с людьми аналогичного возраста и пола, облучёнными в сопоставимых дозах, но не имевшими ХЛС в период максимального радиационного воздействия. Данное предположение соответствует современным представлениям о том, что радиочувствительность при хроническом облучении определяется не столько радиационным повреждением клеток критических систем (кроветворная, иммунная и др.), сколько способностью радиочувствительных тканей к восстановлению (включая репарацию сублетальных повреждений). С учётом этого, представляет интерес сравнительный анализ системного иммунитета у людей вышеуказанных групп в период отдалённых последствий хронического облучения человека. Ранее в ряде исследований было показано, что у населения бассейна реки Течи регистрируются повышенные радиационные риски развития злокачественных новообразований, лейкозов и сердечно-сосудистых заболеваний [6].

Материалы и методы

Известно, что облучение населения прибрежных сёл реки Течи имело хронический характер и определялось как внешним γ -излучением, так и внутренним облучением за счёт радионуклидов, поступивших в организм людей с речной водой и продуктами питания местного производства (молоко, овощи, картофель и др.) [1, 6]. В настоящее исследование включён 61 житель бассейна реки Течи, у которых ранее был диагностирован ХЛС. Группа сравнения формировалась методом «копия-пара» по полу, возрасту ( ± 3 года), дозе облучения ККМ ( ± 0,05 Гр) и включала 61-го облучённого человека, у которых в период максимального радиационного воздействия не был диагностирован ХЛС. Группа сравнения включала жителей прибрежных сёл реки Течи, которые проживали в сходных социально-экономических условиях и имели анало-77

гичный характер медицинского обслуживания. В исследуемых группах преобладали женщины (44 человека – 72,1%). Средний возраст на время исследования у лиц, перенесших ХЛС, составил 71,4 ± 0,9 лет (возрастной диапазон: 59-90 лет), а в группе сравнения – 72,4 ± 0,8 лет (возрастной диапазон: 59-86 лет). Из исследования исключались облучённые люди, имеющие злокачественные новообразования, лейкозы, аутоиммунные и другие заболевания, которые оказывают влияние на иммунитет.

Индивидуальные дозы облучения мягких тканей (МТ), которые аналогичны дозам на тимус, периферические органы иммунной системы, и дозы на ККМ оценивались с использованием дозиметрической системы реки Течи TRDS-2009 [6].

Исследование системного иммунитета проводилось в 2014-2017 гг. и включало анализ показателей, характеризующих функциональное состояние адаптивного иммунитета (Т- и В-звеньев иммунной системы), врождённого иммунитета (нейтрофилов, моноцитов, их фагоцитарной, лизосомальной активности, интенсивности внутриклеточного кислородзависимого метаболизма, численности популяций НК- и НКТ-клеток), а также системы сывороточных цитокинов (ИЛ-1 α , ИЛ-1 β , ИЛ-1RA, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-17, КСФ-ГМ, КСФ-Г, ФНО α , ИФН α , ИФН γ ). Метод CD-типирования также позволил оценить количество клеток, экспрессирующих маркёр CD95, который опосредует рецептор-зависимый апоптоз. Численность субпопуляций лимфоцитов оценивали методом проточной цитофлуорометрии на проточном цитометре Navios (Beckman Coulter, США). Определение фагоцитарной и лизосомальной активности нейтрофилов и моноцитов крови проводили по методу И.С. Фрейдлин [7]. Интенсивность внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофилов и моноцитов оценивали путём постановки НСТ-теста в модификации А.Н. Маянского и М.К. Виксмана [8]. Количественное определение цитокинов в сыворотке крови пациентов проводили методом твёрдофазного имму-ноферментного анализа (ИФА) на автоматическом микропланшетном анализаторе «Lazurite» (DYNEX Technologies, США).

Первичные данные подвергали статистической обработке с использованием базовых методов описательной статистики: расчёт средних значений показателей, ошибок средних и диапазонов вариабельности индивидуальных значений показателей. Сравнение исследуемых групп проводили путём вычисления U-критерия Манна-Уитни. Нулевая гипотеза об отсутствии различий между сравниваемыми группами отклонялась при p<0,05 и принималась альтернативная гипотеза о наличии статистически значимых различий. Статистический анализ результатов проводили с использованием табличного редактора «Microsoft Excel» и пакета прикладных программ «Statistica 10.0».

Результаты и обсуждение

Ранее было показано, что формирование клинических проявлений ХЛС, а также характер его течения и исходы во многом определяются дозами облучения ККМ [1, 2, 9]. Красный костный мозг у жителей прибрежных сёл реки Течи был критическим органом по дозе облучения, которая в значительной мере определялась поступлением в их организм остеотропного 90Sr. Критическими по радиочувствительности костномозговыми клетками являются стволовые кроветворные клетки и клетки-предшественники иммуноцитов. Доза облучения МТ, являющаяся эквивалентом доз облучения тимуса и периферических органов иммунной системы, формиро- валась преимущественно за счёт внешнего γ-излучения и равномерно распределяющегося в тканях организма 137Сs. Данные, представленные в табл. 1, свидетельствуют, что средние значения максимальной мощности дозы и поглощённой дозы облучения ККМ и МТ у облучённых лиц, имевших в анамнезе ХЛС, и в группе сравнения были одинаковыми. Индивидуальные значения кумулятивной дозы облучения ККМ в сравниваемых группах были существенно выше, чем дозы облучения МТ, и достигали 2,7 Гр. Мощность дозы облучения ККМ в период максимального радиационного воздействия (1951 г.) в обеих группах была также существенно выше годовой дозы на МТ и достигала 0,8 Гр.

Таблица 1 Мощность дозы и поглощённая доза облучения в ККМ и МТ у лиц, перенесших ХЛС, и в группе сравнения

Группа	Мощность дозы облучения ККМ (1951 г.), Гр/год	Мощность дозы облучения МТ (1951 г.), Гр/год	Поглощённая доза облучения в ККМ, Гр	Поглощённая доза облучения в МТ, Гр
ХЛС Группа сравнения	0,22 ± 0,02 (0,88)* 0,22 ± 0,02 (0,81)	0,02 ± 0,01 (0,30) 0,02 ± 0,01 (0,25)	0,91 ± 0,08 (2,71) 0,91 ± 0,08 (2,66)	0,05 ± 0,01 (0,41) 0,07 ± 0,01 (0,48)

Примечание: в скобках указаны максимальные значения доз.

Средние значения и диапазоны вариабельности индивидуальных значений показателей адаптивного иммунитета у людей, перенесших ХЛС, и в группе сравнения представлены в табл. 2. Статистически значимые отличия у лиц, перенесших ХЛС, относительно группы сравнения, регистрировались только со стороны клеточного звена адаптивного иммунитета. В отдалённые сроки после начала хронического радиационного воздействия у них отмечено снижение средних значений абсолютного количества CD3+-лимфоцитов, CD4+-лимфоцитов и CD8+-лимфоцитов в периферической крови. Степень выраженности снижения числа CD4+- и CD8+-лимфоцитов была примерно одинаковой и, как результат, их соотношение существенно не отличалось от такового в группе сравнения. Обращал на себя внимание более узкий диапазон вариабельности индивидуальных значений вышеуказанных показателей у лиц, перенесших ХЛС. Функциональное состояние гуморального звена адаптивного иммунитета по основным показателям (количество CD19+-лимфоцитов в периферической крови, а также уровни сывороточных иммуноглобулинов классов A, М и G) у облучённых лиц сравниваемых групп статистически значимо не различалось.

Из табл. 3 и 4 видно, что существенных изменений со стороны большинства показателей врождённого иммунитета у облучённых лиц, имевших в анамнезе ХЛС, не отмечалось. В отдалённые сроки у них зарегистрировано лишь повышение показателей лизосомальной активности нейтрофильных гранулоцитов (ЛАН), тогда как суммарная лизосомальная активность нейтрофилов не отличалась от таковой в группе сравнения. У лиц, перенесших ХЛС, в отдалённые сроки также не было выявлено каких-либо особенностей со стороны системы мононуклеарных фагоцитов относительно группы сравнения.

Таблица 2

Показатели	Люди, перенесшие ХЛС n=61	Группа сравнения n=61	р
Лимфоциты, %	34,31 ± 1,20 (11-54)*	35,95 ± 1,29 (16-60)
Лимфоциты, 10 9 /л	2,00 ± 0,09 (0,82-3,58)	2,27 ± 0,09 (0,86-4,47)
CD3+-лимфоциты ,%	66,91 ± 1,06 (54,2-86,3)	67,97 ± 1,51 (36,8-85,3)
CD3+-лимфоциты,•109/л	1,21 ± 0,07 (0,54-2,13)	1,56 ± 0,09 (0,39-3,30)	0,005
CD4+-лимфоциты,%	42,32 ± 1,08 (20,3-57,6)	41,84 ± 1,25 (19,4-57,9)
CD4+-лимфоциты,•109/л	0,76 ± 0,04 (0,33-1,37)	0,96 ± 0,06 (0,17-1,88)	0,009
CD8+-лимфоциты,%	20,88 ± 1,20 (8,4-42,5)	23,27 ± 1,19 (8,9-43,6)
CD8+-лимфоциты,•109/л	0,38 ± 0,03 (0,10-0,99)	0,54 ± 0,04 (0,16-1,34)	0,003
CD4 + /CD8 +	2,36 ± 0,16 (0,8-5,38)	2,06±0,13 (0,72-3,55)
CD95+-лимфоциты, %	4,25 ± 1,01 (0,03-24,2)	4,40 ± 0,93 (0,3-27,33)
CD95+-лимфоциты,•109/л	0,076 ± 0,018 (0,001-0,398)	0,096 ± 0,020 (0,001-0,477)
СD19+-лимфоциты, %	10,67 ± 0,82 (2,7-28,4)	10,76 ± 0,77 (1,7-36,0)
СD19+-лимфоциты,•109/л	0,19 ± 0,02 (0,04-0,42)	0,23 ± 0,02 (0,04-0,54)
IgA, г/л	2,42 ± 0,21 (0,24-6,62)	2,85 ± 0,22 (0,50-9,00)
IgG, г/л	12,92 ± 1,19 (2,18-40,86)	17,75 ± 1,23 (0,02-38,06)
IgM, г/л	1,19 ± 0,12 (0,11-5,00)	1,45 ± 0,14 (0,07-5,29)

Примечание: в скобках указан диапазон индивидуальных значений показателей.

Таблица 3

Средние значения (M ± m) показателей, характеризующих систему нейтрофильных гранулоцитов, у лиц, перенесших ХЛС, и в группе сравнения

Показатели	Люди, перенесшие ХЛС n=61	Группа сравнения n=61	р
Лейкоциты, 109/л	5,90 ± 0,20 (2,97-10,30)*	6,41 ± 0,21 (3,43-13,40)
Нейтрофилы, %	54,70 ± 1,37 (24-79)	53,08 ± 1,39 (33-80)
Нейтрофилы, 109/л	3,25 ± 0,15 (1,26-6,49)	3,44 ± 0,17 (1,30-9,78)
АФН, %	5,02 ± 0,46 (1,0-17,0)	4,39 ± 0,39 (1,0-13,0)
ИФН, усл. ед.	11,47 ± 1,31 (1,0-42,0)	11,37 ± 1,98 (1-95)
Фагоцитарное число, усл. ед.	2,23 ± 0,17 (1,0-8,25)	2,31 ± 0,22 (1.0-9.0)

Показатели	Люди, перенесшие ХЛС n=61	Группа сравнения n=61	р
НСТ нейтрофилов спонтанный, %	49,11 ± 2,14 (9,0-83,0)	50,48 ± 1,87 (22,0-84,0)
НСТ нейтрофилов индуцированный,%	46,86 ± 1,73 (22,0-79,0)	46,79 ± 1,87 (22,0-83,0)
ЛАН, усл. ед.	493,04 ± 24,27 (194-816)	420,45 ± 14,77 (214-762)	0,018
СЛАН, 10 9 /л	15,27 ± 1,24 (2,82-45,17)	14,48 ± 0,91 (4,71-46,76)

Примечание: в скобках приведён диапазон индивидуальных значений показателей; АФН - активность фагоцитоза нейтрофилов; ИФН - интенсивность фагоцитоза нейтрофилов; НСТ-тест - тест с нитросиним тетразолием; ЛАН - лизосомальная активность нейтрофилов; СЛАН - суммарная лизосомальная активность нейтрофилов.

Таблица 4

Средние значения (M ± m) показателей, характеризующих систему мононуклеарных фагоцитов и цитотоксические клетки, у лиц, перенесших ХЛС, и в группе сравнения

Показатели	Люди, перенесшие ХЛС n=61	Группа сравнения n=61
Моноциты,%	6,72 ± 0,39 (1-15)*	6,67 ± 0,43 (1-16)
Моноциты/109/л	0,39 ± 0,03 (0,09-0,99)	0,42 ± 0,03 (0,04-1,20)
АФМ, %	5,56 ± 0,50 (1,0-16,0)	4,58 ± 0,41 (1,0-14,0)
ИФМ, усл. ед.	12,17 ± 1,41 (1-43)	9,77 ± 1,24 (1-48)
Фагоцитарное число, усл. ед.	2,11 ± 0,15 (1,0-6,83)	2,09 ± 0,18 (1,0-10,25)
НСТ моноцитов спонтанный, %	51,51 ± 1,91 (9-82)	52,07 ± 1,74 (20-83)
НСТ моноцитов индуцированный, %	50,70 ± 1,88 (7-79)	51,74 ± 1,74 (26-87)
ЛАМ, усл. ед.	307,13 ± 13,45 (71-520)	312,79 ± 11,26 (77-455)
СЛАМ, 109/л	1,11 ± 0,09 (0,21-2,87)	1,27 ± 0,10 (0,07-3,82)
СО3-СО16+ОО56+-лимфоциты, %	17,59 ± 1,11 (6,2-38,3)	17,99 ± 1,21 (3,4-48,1)
СО3-СО16+ОО56+-лимфоциты, 109/л	0,34 ± 0,04 (0,08-0,92)	0,41 ± 0,03 (0,05-1,07)
СО3+СО16+ОО56+-лимфоциты, %	6,73 ± 0,80 (1,6-23,5)	5,72 ± 0,57 (0,3-20,6)
СО3+СО16+ОО56+-лимфоциты, 109/л	0,12 ± 0,02 (0,03-0,47)	0,14 ± 0,02 (0,01-0,61)

Примечание: в скобках приведён диапазон индивидуальных значений показателей; АФМ - активность фагоцитоза моноцитов; ИФМ - интенсивность фагоцитоза моноцитов; НСТ-тест - тест с нитросиним тетразо-лием; ЛАМ - лизосомальная активность моноцитов; СЛАМ - суммарная лизосомальная активность моноцитов.

Исследование цитокинового спектра позволило отметить в отдалённые сроки у облучённых людей, имевших ХЛС, повышение уровней ИЛ-4 и ФНОа в сыворотке крови (табл. 5). В то же время, содержание сывороточных факторов роста КСФ-ГМ и КСФ-Г, а также ИФНа и ИФН у них соответствовало таковым в группе облучённых в сопоставимых дозах людей, но не имев- ших ХЛС. Полученные результаты позволили говорить о дисбалансе в системе цитокинов в отдалённые сроки у людей, которые проявляли повышенную радиочувствительность в период максимального радиационного воздействия (1950-1956 гг.). Известно, что ИЛ-4, который продуцируется, главным образом, активированными CD4+-лимфоцитами (Т-хелперы 2 типа), тучными клетками и эозинофилами, регулирует рост и дифференцировку В-лимфоцитов в В-клетки памяти и плазмоциты, процессы биосинтеза и секреции последними иммуноглобулинов, а также подавляет воспалительную реакцию [10]. Повышение уровней сывороточного ИЛ-4 у людей, перенесших ХЛС, было зарегистрировано на фоне снижения абсолютного количества в периферической крови CD4+-лимфоцитов. Хотя показано, что ИЛ-4 подавляет дифференцировку Т-хелперов 1 типа, провоспалительную активность макрофагов и секрецию ими цитокинов, у лиц с ХЛС не отмечалось снижения содержания ИФНY, ИЛ-1, ИЛ-2 и ИЛ-6 в сыворотке крови, а уровень ФНОа был даже повышен. В отличие от ИЛ-4, ФНОа, который синтезируется моноцитами, макрофагами и CD8+-лимфоцитами, стимулирует продукцию ими ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИФН-/ и обладает плейотропным провоспалительным действием. Кроме того, ФНОα, связываясь с рецептором CD95, экспрессирующимся на мембранах старых, повреждённых и опухолевых клеток, обусловливает их рецептор-зависимый апоптоз. Важно отметить, что нарушения регуляции ФНОа у человека ассоциированы со злокачественными новообразованиями [11].

Таблица 5

Средние (M ± m) значения содержания цитокинов в сыворотке крови у лиц, перенесших ХЛС, и в группе сравнения

Показатель	Люди, перенесшие ХЛС n=59	Группа сравнения n=59	р
ИЛ-1 а , пг/мл	0,68 ± 0,20 (0,07-1,90)	0,93 ± 0,13 (0,06-1,95)
ИЛ-1 в , пг/мл	56,75 ± 21,09 (0,04-833,35)*	48,41 ± 13,05 (0,06-480,0)
ИЛ-1 RA, пг/мл	185,75 ± 55,95 (76,44-371,10)	359,94 ± 152,65 (43,75-1836,92)
ИЛ-2, пг/мл	11,76 ± 1,40 (0,38-35,50)	11,88 ± 2,57 (0,01-112,55)
ИЛ-4, пг/мл	6,71 ± 0,99 (0,28-35,99)	3,99 ± 0,70 (0,14-23,94)	0,002
ИЛ-6, пг/мл	15,00 ± 5,90 (0,10-340,30)	14,47 ± 5,98 (0,02-345,00)
ИЛ-8, пг/мл	7,31 ± 1,66 (0,19-60,71)	10,61 ± 4,23 (0,14-195,90)
ИЛ-10, пг/мл	9,96 ± 2,33 (0,24-122,03)	11,28 ± 1,62 (0,22-65,27)
ИЛ-17, пг/мл	3,09 ± 0,83 (0,17-5,52)	2,63 ± 0,34 (0,85-5,21)
КСФ-ГМ, пг/мл	2,65 ± 0,80 (0,25-8,03)	2,55 ± 0,50 (0,08-9,72)
КСФ-Г, пг/мл	5,10 ± 1,10 (1,25-15,32)	5,25 ± 0,91 (0,02-20,60)
ФНО а , пг/мл	6,18 ± 0,48 (0,71-21,92)	4,25 ± 0,42 (0,03-16,79)	0,001
ИФН а , пг/мл	4,70 ± 0,96 (0,58-15,35)	6,04 ± 0,81 (0,08-21,02)
ИФН у , пг/мл	19,58 ± 3,16 (0,16-128,00)	16,09 ± 3,10 (0,15-146,65)

Примечание: в скобках приведён диапазон индивидуальных значений показателей.

Анализ вариабельности показателей системного иммунитета в сравниваемых группах показал близость диапазонов индивидуальных значений. Данный факт свидетельствовал об отсутствии выраженных изменений в системе иммунитета у облучённых лиц, что говорило об отсутствии у них признаков вторичного иммунодефицита.

Заключение

Результаты сравнительного анализа системного иммунитета у хронически облучённых лиц в сопоставимых дозах, перенесших ХЛС и не имевших симптомов ХЛС, демонстрируют, что индивидуальная радиочувствительность человека может иметь существенное значение не только для развития ХЛС, но и для формирования отдалённых эффектов облучения. Спустя 65 лет после начала хронического радиационного воздействия у лиц, проживающих в населённых пунктах береговой зоны реки Течи и перенесших ХЛС, в периферической крови отмечены более низкие значения абсолютного количества CD3⁺-лимфоцитов, CD4⁺-лимфоцитов и CD8⁺-лимфоцитов, а также повышение уровней ИЛ-4 и ФНО α в сыворотке крови по сравнению с людьми аналогичного возраста и пола, облучёнными в сопоставимых дозах. Вышеуказанные изменения свидетельствовали о некотором угнетении клеточного звена адаптивного иммунитета и наличии дисбаланса цитокинов. Однако, ни в одном случае не было диагностировано вторичного иммунодефицита у людей, ранее перенесших ХЛС. Можно предположить, что выявленные особенности иммунитета могут играть определённую роль в развитии отдалённых радиационных эффектов.

Авторы благодарят заведующего отделом Базы данных «Человек» ФГБУН УНПЦ РМ Н.В. Старцева за помощь в формировании исследуемых групп. Работа выполнена по контракту № 27.501.14.2 от 25.02.2014 г. в рамках ФЦП «Обеспечение ядерной и радиационной безопасности на 2008 год и на период до 2015 года».

Средние (M ± m) значения показателей адаптивного иммунитета у лиц, перенесших ХЛС, и в группе сравнения