Особенности использования флуоресцентных репортерных белков для изучения развития корневых систем на примере тыквенных (Cucurbitaceae)

Особенности использования флуоресцентных репортерных белков для изучения развития корневых систем на примере тыквенных (Cucurbitaceae)

Автор: Ильина Е.Л., Кирюшкин А.С., Демченко К.Н.

Журнал: Сельскохозяйственная биология @agrobiology

Рубрика: Методы исследований

Статья в выпуске: 5 т.55, 2020 года.

Бесплатный доступ

Современные исследования тонких процессов развития растений невозможно представить без использования широкого спектра флуоресцентных белков (R. Day и M. Davidson, 2009; D. Chudakov с соавт., 2010), применение которых, однако, ограничено из-за несовершенства приемов их визуализации в растительных тканях. Растения представляют собой сложные объекты для микроскопических исследований: даже применение наиболее совершенных методов имеет значительное ограничение по глубине проникновения света по причине его рассеивания и поглощения клеточными стенками. Соответственно, для изучения распределения репортерных флуоресцентных белков в крупных органах, типичных для большинства растений, необходима фиксация растительного материала и приготовление толстых гистологических срезов с помощью микротома с вибрирующим лезвием. Химические вещества, традиционно используемые для фиксации, обезвоживания и заключения растительных образцов в заливочную среду приводят к изменению структуры флуоресцентных белков и, как следствие, к потере флуоресценции. Поэтому сохраняется актуальность оптимизации протоколов фиксации тканей растений, приготовления срезов, а также изучения распределения флуоресцентных белков при помощи лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. В представленной работе нами впервые предложен комплексный подход к фиксации тканей трансгенных растений и приготовлению срезов при изучении паттернов клеточного ответа на ауксин и экспрессии транскрипционных факторов с применением лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Нашей целью было обобщение современных подходов в использовании эффективной универсальной методики визуализации тканевого и клеточного паттернов распределения флуоресцентных репортерных белков на срезах крупных органов немодельных растений. Первый шаг для использования флуоресцентных белков в растениях - создание генетических конструкций, несущих гены интереса и гены репортерных флуоресцентных белков. При этом необходимо наличие оптимальной методики трансформации для выбранного вида растений. В работе описано применение технологии клонирования Gateway® для получения векторов для трансформации растений, отвечающих современным экспериментальным задачам. Для изучения локализации ауксина in vivo мы получили серию векторов с генами, кодирующими флуоресцентные белки (eGFP, tdTomato, mRuby3), под контролем ауксин-чувствительного промотора DR5 (E. Ilina с соавт., 2012). Продемонстрировано преимущество использования ярких флуоресцентных белков с ядерной локализацией (mNeonGreen-H2B, tdTomato-H2B, mRuby3-H2B), а также возможность их применения для дополнительной визуализации ядер клеток в сочетании с высокоспецифичным окрашиванием клеточных стенок красителем SCRI Renaissance2200. Представлена методика конструирования векторов для изучения тканевого паттерна экспрессии генов регуляторов развития на примере ранее идентифицированных нами генов транскрипционных факторов GATA24 (А. Kiryushkin с соавт., 2019) и LBD16 у представителей семейства Cucurbitaceae (Тыквенные). На примере кассеты pAtUBQ10::DsRED1 (E. Limpens с соавт., 2004), несущей ген красного флуоресцентного белка под управлением конститутивного промотора, продемонстрирована высокая эффективность использования флуоресцентных белков для скрининга трансгенных органов растений. Представлена новая методика фиксации и просветления растительных тканей, содержащих репортерные флуоресцентные белки, и приготовления срезов на примере трансгенных корней у тыквенных. Показано преимущество использования расплавленной агарозы для ориентации растительных объектов при пробоподготовке по сравнению с заливочными средами. Также показано значение модифицированной нами заключающей просветляющей среды ClearSee (D. Kurihara с соавт., 2015) для повышения фотостабильности флуоресцентного белка на срезах. Таким образом, продемонстрированы преимущества, которые предоставляет применение комплекса современных методических подходов пробоподготовки и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии для изучения биологии развития крупных немодельных растений.

Еще

Агробактериальная трансформация, флуоресцентные белки, конфокальная микроскопия, развитие растений, транскрипционные факторы

Короткий адрес: https://sciup.org/142229429

IDR: 142229429   |   DOI: 10.15389/agrobiology.2020.5.1040rus

Список литературы Особенности использования флуоресцентных репортерных белков для изучения развития корневых систем на примере тыквенных (Cucurbitaceae)

  • Cesarino I., Ioio R.D., Kirschner G.K., Ogden M.S., Picard K.L., Rast-Somssich M.I., Somssich M. Plant science's next top models. Annals of Botany, 2020, 126(1): 1-23 (doi: 10.1093/aob/mcaa063).
  • Che G., Gu R., Zhao J., Liu X., Song X., Zi H., Cheng Z., Shen J., Wang Z., Liu R., Yan L., Weng Y., Zhang X. Gene regulatory network controlling carpel number variation in cucumber. Development, 2020, 147(7): dev184788 (doi: 10.1242/dev.184788).
  • Ilina E.L., Logachov A.A., Laplaze L., Demchenko N.P., Pawlowski K., Demchenko K.N. Composite Cucurbita pepo plants with transgenic roots as a tool to study root development. Annals of Botany, 2012, 110(2): 479-489 (doi: 10.1093/aob/mcs086).
  • Osipowski P., Pawelkowicz M., Wojcieszek M., Skarzynska A., Przybecki Z., Pl^der W. A high-quality cucumber genome assembly enhances computational comparative genomics. Mol. Genet. Genomics, 2020, 295(1): 177-193 (doi: 10.1007/s00438-019-01614-3).
  • Day R.N., Davidson M.W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society Reviews, 2009, 38(10): 2887-2921 (doi: 10.1039/B901966A).
  • Chudakov D.M., Matz M.V., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiological Review, 2010, 90(3): 1103-1163 (doi: 10.1152/physrev.00038.2009).
  • Mathur J. The illuminated plant cell. Trends in Plant Science, 2007, 12(11): 506-513 (doi: 10.1016/j.tplants.2007.08.017).
  • Berg R.H., Beachy N.R. Fluorescent protein applications in plants. Methods in Cell Biology, 2008, 85: 153-177 (doi: 10.1016/S0091-679X(08)85008-X).
  • Kurihara D., Mizuta Y., Sato Y., Higashiyama T. ClearSee: a rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development, 2015, 142(23): 4168-4179 (doi: 10.1242/dev.127613).
  • Ursache R., Andersen T.G., Marhavy P., Geldner N. A protocol for combining fluorescent proteins with histological stains for diverse cell wall components. Plant J., 2018, 93(2): 399-412 (doi: 10.1111/tpj.13784).
  • Nagaki K., Yamaji N., Murata M. ePro-ClearSee: a simple immunohistochemical method that does not require sectioning of plant samples. Scientific Reports, 2017, 7: 42203 (doi: 10.1038/srep42203).
  • Truernit E., Bauby H., Dubreucq B., Grandjean O., Runions J., Barthélémy J., Palauqui J.-C. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell, 2008, 20(6): 1494 (doi: 10.1105/tpc.107.056069).
  • Mizuta Y., Kurihara D., Higashiyama T. Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues. Protoplasma, 2015, 252(5): 1231-1240 (doi: 10.1007/s00709-014-0754-5).
  • FeyY J.A., Moreno N. Imaging plant cells by two-photon excitation. Protoplasma, 2004, 223(1): 1-32 (doi: 10.1007/s00709-003-0026-2).
  • Girkin J.M., Carvalho M.T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics, 2018, 20(5): 053002 (doi: 10.1088/2040-8986/aab58a).
  • Ovecka M., Vaskebova L., Komis G., Luptovciak I., Smertenko A., Samaj J. Preparation of plants for developmental and cellular imaging by light-sheet microscopy. Nature Protocols, 2015, 10: 1234 (doi: 10.1038/nprot.2015.081).
  • Valuchova S., Mikulkova P., Pecinkova J., Klimova J., Krumnikl M., Bainar P., Heckmann S., Tomancak P., Riha K. Imaging plant germline differentiation within Arabidopsis flowers by light sheet microscopy. eLife, 2020, 9: e52546 (doi: 10.7554/eLife.52546).
  • Ovecka M., von Wangenheim D., Tomancak P., Samajova O., Komis G., Samaj J. Multiscale imaging of plant development by light-sheet fluorescence microscopy. Nature Plants, 2018, 4(9): 639-650 (doi: 10.1038/s41477-018-0238-2).
  • Knapp E., Flores R., Scheiblin D., Modla S., Czymmek K., Yusibov V. A cryohistological protocol for preparation of large plant tissue sections for screening intracellular fluorescent protein expression. BioTechniques, 2012, 52(1): 31-37 (doi: 10.2144/000113778).
  • Shaner N.C., Lambert G.G., Chammas A., Ni Y., Cranfill P.J., Baird M.A., Sell B.R., Allen J.R., Day R.N., Israelsson M., Davidson M.W., Wang J. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nat. Methods, 2013, 10(5): 407409 (doi: 10.1038/nmeth.2413).
  • Bindels D.S., Haarbosch L., van Weeren L., Postma M., Wiese K.E., Mastop M., Aumonier S., Gotthard G., Royant A., Hink M.A., Gadella Jr T.W.J. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat. Methods, 2016, 14: 53 (doi: 10.1038/nmeth.4074).
  • Ivanov S., Harrison M.J. A set of fluorescent protein-based markers expressed from constitutive and arbuscular mycorrhiza-inducible promoters to label organelles, membranes and cytoskeletal elements in Medicago truncatula. Plant J, 2014, 80(6): 1151-1163 (doi: 10.1111/tpj.12706).
  • Curtis M.D., Grossniklaus U. A Gateway cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in planta. Plant Physiology, 2003, 133(2): 462-469 (doi: 10.1104/pp.103.027979).
  • Engler C., Youles M., Gruetzner R., Ehnert T.-M., Werner S., Jones J.D.G., Patron N.J., Marillonnet S. A Golden Gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology, 2014, 3(11): 839-843 (doi: 10.1021/sb4001504).
  • Karimi M., Inze D., Depicker A. GATEWAY(TM) vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends in Plant Science, 2002, 7(5): 193-195 (doi: 10.1016/S1360-1385(02)02251-3).
  • Landy A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annu. Rev. Biochem., 1989, 58(1): 913-941 (doi: 10.1146/annurev.bi.58.070189.004405).
  • Hornung E., Krueger C., Pernstich C., Gipmans M., Porzel A., Feussner I. Production of (10E,12Z)-conjugated linoleic acid in yeast and tobacco seeds. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) — Molecular and Cell Biology of Lipids, 2005, 1738(1-3): 105-114 (doi: 10.1016/j.bbalip.2005.11.004).
  • Op den Camp R.H.M., De Mita S., Lillo A., Cao Q., Limpens E., Bisseling T., Geurts R. A phylogenetic strategy based on a legume-specific whole genome duplication yields symbiotic cytokinin type-A response regulators. Plant Physiology, 2011, 157(4): 2013-2022 (doi: 10.1104/pp.111.187526).
  • Limpens E., Ramos J., Franken C., Raz V., Compaan B., Franssen H., Bisseling T., Geurts R. RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula. Journal of Experimental Botany, 2004, 55(399): 983-992 (doi: 10.1093/jxb/erh122).
  • Tsai F.Y., Coruzzi G. Light represses transcription of asparagine synthetase genes in photosynthetic and nonphotosynthetic organs of plants. Mol. Cell. Biol., 1991, 11(10): 4966-4972 (doi: 10.1128/mcb.11.10.4966).
  • Ulmasov T., Murfett J., Hagen G., Guilfoyle T.J. Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell, 1997, 9(11): 1963-1971 (doi: 10.1105/tpc.9.11.1963).
  • Nam H.-S., Benezra R. High levels of Id1 expression define B1 type adult neural stem cells. Cell Stem Cell, 2009, 5(5): 515-526 (doi: 10.1016/j.stem.2009.08.017).
  • Shaner N.C., Steinbach P.A., Tsien R.Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods, 2005, 2(12): 905-909 (doi: 10.1038/nmeth819).
  • Bajar B.T., Wang E.S., Lam A.J., Kim B.B., Jacobs C.L., Howe E.S., Davidson M.W., Lin M.Z., Chu J. Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting. Scientific Reports, 2016, 6(20889): 1-12 (doi: 10.1038/srep20889).
  • Goh T., Joi S., Mimura T., Fukaki H. The establishment of asymmetry in Arabidopsis lateral root founder cells is regulated by LBD16/ASL18 and related LBD/ASL proteins. Development, 2012, 139(5): 883-893 (doi: 10.1242/dev.071928).
  • De Rybel B., Vassileva V., Parizot B., Demeulenaere M., Grunewald W., Audenaert D., Van Campenhout J., Overvoorde P., Jansen L., Vanneste S., Möller B., Wilson M., Holman T., Van Isterdael G., Brunoud G., Vuylsteke M., Vernoux T., De Veylder L., Inze D., Weijers D., Bennett M.J., Beeckman T. A novel Aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity. Current Biology, 2010, 20(19): 1697-1706 (doi: 10.1016/j.cub.2010.09.007).
  • Kiryushkin A.S., Ilina E.L., Puchkova V.A., Guseva E.D., Pawlowski K., Demchenko K.N. Lateral root initiation in the parental root meristem of cucurbits: Old players in a new position. Front. Plant Sci., 2019, 10: 365 (doi: 10.3389/fpls.2019.00365).
  • Hostettler L., Grundy L., Käser-Pebernard S., Wicky C., Schafer W.R., Glauser D.A. The bright fluorescent protein mNeonGreen facilitates protein expression analysis in vivo. G3: Genes, Genomes, Genetics, 2017, 7(2): 607-615 (doi: 10.1534/g3.116.038133).
  • Balleza E., Kim J.M., Cluzel P. Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells. Nat. Methods, 2017, 15: 47 (doi: 10.1038/nmeth.4509).
  • Nagai T., Ibata K., Park E.S., Kubota M., Mikoshiba K., Miyawaki A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol., 2002, 20(1): 87-90 (doi: 10.1038/nbt0102-87).
  • Yoo S.Y., Bomblies K., Yoo S.K., Yang J.W., Choi M.S., Lee J.S., Weigel D., Ahn J.H. The 35S promoter used in a selectable marker gene of a plant transformation vector affects the expression of the transgene. Planta, 2005, 221(4): 523-530 (doi: 10.1007/s00425-004-1466-4).
  • Zheng X.L., Deng W., Luo K.M., Duan H., Chen Y.Q., McAvoy R., Song S.Q., Pei Y., Li Y. The cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter sequence alters the level and patterns of
  • activity of adjacent tissue- and organ-specific gene promoters. Plant Cell Rep., 2007, 26(8): 11951203 (doi: 10.1007/s00299-007-0307-x).
  • Samac D.A., Tesfaye M., Dornbusch M., Saruul P., Temple S.J. A comparison of constitutive promoters for expression of transgenes in alfalfa (Medicago sativa). Transgenic Res., 2004, 13(4): 349-361 (doi: 10.1023/B:TRAG.0000040022.84253.12).
  • An Y.-Q., McDowell J.M., Huang S., McKinney E.C., Chambliss S., Meagher R.B. Strong, constitutive expression of the Arabidopsis ACT2/ACT8 actin subclass in vegetative tissues. The Plant Journal, 1996, 10(1): 107-121 (doi: 10.1046/j.1365-313X.1996.10010107.x).
  • Vermeer J.E.M., von Wangenheim D., Barberon M., Lee Y., Stelzer E.H.K., Maizzel A., Geldner N. A spatial accommodation by neighboring cells is required for organ initiation in Arabidopsis. Science, 2014, 343(6167): 178-183 (doi: 10.1126/science.1245871).
  • Chen Z., Wang J., Ye M.-X., Li H., Ji L.-X., Li Y., Cui D.-Q., Liu J.-M., An X.-M. A novel moderate constitutive promoter derived from poplar (Populus tomentosa Carrière). Int. J. Mol. Sci., 2013, 14(3): 6187-6204 (doi: 10.3390/ijms14036187).
  • Benjamins R., Quint A., Weijers D., Hooykaas P., Offringa R. The PINOID protein kinase regulates organ development in Arabidopsis by enhancing polar auxin transport. Development, 2001, 128(20): 4057-4067.
  • McLean I.W., Nakane P.K. Periodate-lysine-paraformaldehyde fixative a new fixative for immunoelectron microscopy. Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 1974, 22(12): 1077-1083 (doi: 10.1177/22.12.1077).
  • Kitaeva A.B., Kusakin P.G., Demchenko K.N., Tsyganov V.E. Key methodological features of tubulin cytoskeleton studies in nodules of legume plants. Agricultural Biology [Sel'skokhozyaistvennaya Biologiya], 2018, 53(3): 634-644 (doi: 10.15389/agrobiology.2018.3.634eng).
  • Kitaeva A.B., Demchenko K.N., Tikhonovich I.A., Timmers A.C.J., Tsyganov V.E. Comparative analysis of the tubulin cytoskeleton organization in nodules of Medicago truncatula and Pisum sativum: Bacterial release and bacteroid positioning correlate with characteristic microtubule rearrangements. New Phytol., 2016, 210(1): 168-183 (doi: 10.1111/nph.13792).
  • Musielak T.J., Schenkel L., Kolb M., Henschen A., Bayer M. A simple and versatile cell wall staining protocol to study plant reproduction. Plant Reprod., 2015, 28(3): 161-169 (doi: 10.1007/s00497-015-0267-1).
  • Zdyb A., Demchenko K., Heumann J., Mrosk C., Grzeganek P., Göbel C., Feussner I., Pawlowski K., Hause B. Jasmonate biosynthesis in legume and actinorhizal nodules. New Phytol., 2011, 189(2): 568-579 (doi: 10.1111/j.1469-8137.2010.03504.x).
  • Stumpe M., Göbel C., Demchenko K., Hoffmann M., Klösgen R.B., Pawlowski K., Feussner I. Identification of an allene oxide synthase (CYP74C) that leads to formation of a-ketols from 9-hydroperoxides of linoleic and linolenic acid in below-ground organs of potato. The Plant Journal, 2006, 47(6): 883-896 (doi: 10.1111/j.1365-313X.2006.02843.x).
  • Demchenko K., Zdyb A., Feussner I., Pawlowski K. Analysis of the subcellular localisation of lipoxygenase in legume and actinorhizal nodules. Plant Biology, 2012, 14(1): 56-63 (doi: 10.1111/j.1438-8677.2011.00480.x).
  • Ilina E.L., Kiryushkin A.S., Semenova V.A., Demchenko N.P., Pawlowski K., Demchenko K.N. Lateral root initiation and formation within the parental root meristem of Cucurbita pepo: is auxin a key player? Annals of Botany, 2018, 122(5): 873-888 (doi: 10.1093/aob/mcy052).
  • Prunet N., Jack T.P., Meyerowitz E.M. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Developmental Biology, 2016, 419(1): 114-120 (doi: 10.1016/j.ydbio.2016.03.018).
  • Dickinson M.E., Bearman G., Tille S., Lansford R., Fraser S.E. Multi-spectral imaging and linear unmixing add a whole new dimension to laser scanning fluorescence microscopy. BioTechniques, 2001, 31(6): 1272-1278 (doi: 10.2144/01316bt01).
  • Kraus B., Ziegler M., Wolff H. Linear fluorescence unmixing in cell biological research. In: Modern research and educational topics in microscopy /A. Méndez-Vilas, J. Diaz (eds.). Formatex, Badajoz, Spain, 2007: 863-872.
  • Mylle E., Codreanu M.-C., Boruc J., Russinova E. Emission spectra profiling of fluorescent proteins in living plant cells. Plant Meth., 2013, 9(1): 10 (doi: 10.1186/1746-4811-9-10).
  • Zimmermann T., Rietdorf J., Pepperkok R. Spectral imaging and its applications in live cell microscopy. FEBS Letters, 2003, 546(1): 87-92 (doi: doi:10.1016/S0014-5793(03)00521-0).
  • Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Сухорукова Е.Г., Колос Е.А., Карпенко М.Н., Суфиева Д.А., Назаренкова А.В. Молекулярная морфология. Методы флуоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии. СПб, 2014.
Еще
Статья научная
QR-код для установки приложения SciUp Наведите камеру и скачайте бесплатное приложение SciUp