Особенности ядовитого секрета Гадюки ренара (Vipera renardi) из Волгоградской области

птиц и их яиц [1, 2]. В Нижнем Поволжье летом и осенью прямокрылые насекомые составляют главную или значительную часть рациона питания восточной степной гадюки [2, 11]. Именно по этой причине для определения среднесмертельной дозы яда данного вида змей в качестве объекта воздействия нами были выбраны сверчки как представители отряда прямокрылых.

Целью данной работы явился анализ свойств ядовитого секрета восточной степной гадюки на примере гадюк из Камышинского района Волгоградской области.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Образцы ядовитого секрета. В работе использовали ядовитый секрет 20 особей восточной степной гадюки (гадюки Ренара) номинативного подвида V. r. renardi. Животные были отловлены 23-25 мая 2013 г. в окрестностях с. Верхняя Добринка Камышинского района Волгоградской области и выпущены 20 августа 2013 г. вместе с появившимся в неволе потомством в место отлова. Ядовитый секрет получали в лаборатории механическим способом, массируя пальцами ядовитые железы. При этом яд от каждой гадюки собирали в отдельные чашки Петри, т.е. для определения ЛД₅₀ и активностей ферментов ядовитого секрета от пойманных гадюк использовали индивидуальные образцы. Яд высушивали 12-14 дней при комнатной температуре в эксикаторе над хлористым кальцием. После достижения постоянной массы образцы яда собирали и хранили в полипропиленовых микропробирках (1,5 мл) в холодильнике.

Отловленные самки оказались беременными, и от них впоследствии, при террариумном содержании, удалось получить потомство. Через неде- лю после рождения у молодых гадюк собрали ядовитый секрет. Яд от родившихся змей собирали не в чашки Петри, а на предметное стекло с зашлифованной кромкой, чтобы не травмировать ротовую полость. В силу малого количества яда, получаемого от одной родившейся гадюки, которого недостаточно для анализа свойств используемыми методами, на одно предметное стекло собирали яд от родившихся гадюк из одного помета, т.е. для анализа яда новорожденных на токсичность мы использовали «объединенные» образцы яда гадюк из помета одной самки. После сушки яд соскабливали со стекла и анализировали также, как и яд взрослых особей.

Экспериментальные животные. Все токсикометрические эксперименты проводили на лабораторной культуре домовых сверчков Acheta do-mesticus , которых разводили и выращивали в сухом термостатируемом помещении при температуре 27-30ºС и относительной влажности 20-25%. Сверчков содержали в пластиковых контейнерах 60×40×40 см. Кормом служили сухая смесь (молотые овсяные хлопья, сухое молоко, сухой гам-марус, рыбная витаминная добавка «Тетрамин») и свежие овощи (морковь, салат, капуста). В качестве поилки использовали смоченную водой губку в пластиковой чашке Петри.

В работе использовали сверчков в возрасте 1,5 месяцев (стадия предимаго) массой 0,26-0,34 г. Для экспериментов формировали группы сверчков массой 0,26-0,28, 0,28-0,30, 0,30-0,32 и 0,320,34 г. Для расчета эффективных доз яда использовали среднюю массу сверчков в группе.

Токсикометрия. В экспериментах использовали свежеприготовленные водные растворы ядовитого секрета гадюк в концентрации 1,0 и 2,0 мг/мл (яд взрослых особей) и 0,5 и 1,0 мг/мл (ядовитый секрет новорожденных).

Инъекции растворов ядов сверчкам проводили внутрибрюшинно: раствор яда (1, 3, 5, 7 и 10 мкл) вводили микрошприцом в нижнюю половину брюшка с дорзальной стороны. Для определения значения ЛД 50 одного образца яда использовали 25 сверчков одной весовой группы – 5 эффективных доз по 5 сверчков для каждой. В день проведения острого опыта сверчков не кормили и убирали поилку. Для исключения возможного влияния температурного фактора контейнеры со сверчками после инъекций яда инкубировали в биологическом термостате BT-120 при температуре 28,0ºС в течение 24 часов, после чего острый опыт прекращали, фиксируя количество мертвых и выживших насекомых. Значение ЛД 50 рассчитывали методом модифицированного пробит-анализа [4]. Определение среднесмертельной дозы одного образца яда проводили не менее чем в двух независимых экспериментах, и для статистической обработки результатов приводили средние величины.

В качестве контроля использовали группы из 5 сверчков той же массы, которым вместо раствора яда вводили максимальный объем (10 мкл) дистиллированной воды. Без пищи и воды сверчки контрольной группы обходились до трех суток, в дальнейшем у них наблюдали каннибализм.

Определение активности протеолитических ферментов проводили в стандартных условиях с казеином в качестве субстрата [7, 18].

Определение активности оксидазы L-аминокислот проводили также в стандартных условиях с использованием в качестве субстрата L-фенилаланина [21].

Содержание белка в образцах ядовитого секрета определяли методом Лоури [14].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Ядопродуктивность гадюк. Количество сухого секрета за одно ядовзятие у взрослой особи варьировало от 7,0 до 44,0 мг при средней ядо-продуктивности на одну особь 23,2±1,93 мг ( n =20). Наибольшие количества яда получены от наиболее крупных змей – 44 мг (самка) и 41 мг (самец). Несмотря на то, что в исследуемой популяции гадюк Ренара самки в среднем были крупнее самцов, статистически значимых различий в ядопродуктивности самок (26,6±3,68 мг/особь) и самцов (21,4±2,16 мг/особь) не выявлено ( t ф =1,306; Р >0,05). Такие количества ядовитого секрета позволили нам определить в каждом образце яда не только активности ферментов – протеазы и оксидазы L-аминокислот, но и среднесмертельную дозу ЛД 50 яда для сверчков.

Ядопродуктивность новорожденных особей мы могли оценить лишь как среднюю величину сухого яда в расчете на одного новорожденного в помете одной самки, т.к. в большинстве случаев яд собирали вместе на одно стекло от всех новорожденных в помете. Так, от 17 новорожденных из одного помета удалось получить 1,6 мг сухого яда, и среднее значение для одной особи из этого помета составило 0,09 мг. Эта величина оказалась максимальной, в остальных 5 пометах выход яда был ниже и составил соответственно 0,02, 0,03, 0,03, 0,05 и 0,06 мг сухого яда на одну особь. У части новорожденных гадюк (16 гадючат из помета одной самки) мы получили ядовитый секрет от каждой особи на отдельном предметном стекле. Высохший яд растворили в 600 мкл физиологического раствора и определили в этих индивидуальных образцах активности протеаз и оксидазы L-аминокислот.

Токсичность ядовитого секрета. Все результаты по определению ЛД 50 яда гадюк из «волгоградской» популяции представлены в табл. 1.

Как видно из данных табл. 1, размах варьирования значений ЛД50 образцов яда взрослых гадюк определен как 12,1-35,3 мкг/г, а среднее значение ЛД50 составляет 23,7±1,71 мкг/г. Получен- ный нами результат мало отличается от результа- также на банановых сверчках мы определили тов В.Г. Старкова с соавторами [19]: среднесмер- ЛД50 объединенного образца яда ренаровых га-тельная доза образца яда V. renardi из Краснодар- дюк, отловленных в Астраханской области – ского края, определенная ими на банановых 21,1±3,28 мкг/г [10] (Ширяева, 2011). Таким обра-сверчках Gryllus assimilis, составляет 19,3 мкг/г. зом, в трех независимых сериях экспериментов Различия могут объясняться тем, что мы работали разными авторами получены сопоставимые рес другим видом сверчков и тем, что мы использо- зультаты.

вали сверчков меньшей массы. Кроме того, ранее

Таблица 1. Значения ЛД 50 ядовитого секрета гадюк Ренара для домовых сверчков

ЛД 50 , мкг/г ядовитый секрет              n          M±m50lim              t ф	P
самки                                  6         23,0±3,32           12,1-34,7 самцы                                 10        24,2±2,01           14,8-35,3           0,329	>0,05
самцы (желтый яд)                    6        27,2±1,94          22,6-35,3          2266 самцы (бесцветный яд)                   4          19,5±3,01            14,8-28,1            ,	>0,05
взрослые                               16        23,7±1,71           12,1-35,3          2329 новорожденные                        2         12,1±1,35           10,0-14,6           ,	<0,05

Примечание: n – количество образцов яда, использованных при анализе на токсичность; жирным шрифтом выделены выявленные статистически значимые различия

Размах варьирования среднесмертельной дозы исследуемых образцов яда (10,0-35,3 мкг/г) показывает более чем трехкратное различие между минимумом и максимумом и говорит о том, что в популяции сосуществуют особи с высоко- и низкотоксичным для насекомых ядовитым секретом. Вполне вероятно, что эти особенности ядовитого секрета могут накладывать отпечаток на особенности питания отдельных особей. Тем более что в той же работе В.Г. Старкова с соавторами [19] показано, что межвидовые различия в токсичности яда нескольких видов гадюк для сверчков связаны с энтомофагией – чем выше процент прямокрылых в рационе данного вида гадюк, тем токсичнее для насекомых их ядовитый секрет. Вполне возможно, что те же механизмы определяют и внутрипопуляционный диапазон изменчивости среднесмертельной дозы яда.

При сравнении значений ЛД 50 яда самок и самцов в исследуемой популяции статистически значимых различий обнаружено не было (табл. 1). Ранее нам также не удалось обнаружить различий в токсичности, обусловленных полом у обыкновенных гадюк, при определении ЛД 50 яда гадюк на мышах [6]. Большинство исследователей считают, что пол змеи не является определяющей причиной особенностей свойств ее ядовитого секрета [12, 13, 17].

Отловленные самки гадюк (n=7) продуцировали ядовитый секрет желтого цвета. У части самцов в выборке (n=9) мы также наблюдали яд желтого цвета, а у части самцов (n=4) ядовитый секрет был бесцветный. Анализ значений ЛД50 показал, что цвет яда (зависящий от активности оксидазы L-аминокислот) не влияет на величину его токсичности. Сравнение выборочных средних показывает отсутствие статистически значимых различий в значениях ЛД50 желтых и бесцветных образцов ядов (табл. 1). Аналогичный факт был отмечен нами и при определении ЛД50 яда обыкновенной гадюки на сеголетках озерной лягушки [8]. Эти результаты позволяют высказать предположение, что токсичность ядовитого секрета гадюк не зависит напрямую от активности оксидазы L-аминокислот в нем, несмотря на то, что в ядах змей оксидаза L-аминокислот является мульти-функциональным ферментом и обладает разнообразными фармакологическими эффектами [20].

Сравнение ЛД 50 яда взрослых особей и новорожденных показывает наличие статистически значимых различий в токсичности их ядовитого секрета – для сверчков яд новорожденных гадюк оказался примерно в 2 раза токсичнее, чем ядовитый секрет взрослых особей (табл. 1). К сожалению, недостаточное количество ядовитого секрета у новорожденных позволило нам определить значения ЛД 50 лишь в образцах яда новорожденных из двух пометов.

В настоящее время мы затрудняемся объяснить выявленные онтогенетические различия. Ряд исследователей считают, что стартовым кормом для новорожденных гадюк, инициирующим инстинкт хищника, являются именно прямокрылые насекомые [19]. Вполне вероятно, что возрастные различия связаны с большим значением насекомых в питании молодых гадюк. Можно также предположить, что из-за очень малого количества яда, выделяемого новорожденными гадюками, для быстрого умерщвления насекомых его токсичность должна быть более высокой, чем у взрослых особей. Литературные данные также говорят в пользу того, что в процессе онтогенеза меняется не только ядопродуктивность особей, но также токсичность и состав яда. У некоторых видов североамериканских гремучников рода Crota-lus было отмечено, что ядовитый секрет новоро- жденных более токсичен, чем яд взрослых особей, но имеет более низкий уровень активности протеиназ [15]. Эти онтогенетические различия связывают с изменениями в пищевом рационе - с ростом змеи увеличиваются физические размеры добычи и/или меняется ее тип. Предполагается, что данный «онтогенетический сдвиг» в пищевом рационе змей может быть широко распространен среди гадюковых змей и вероятно связан с изменениями в составе яда [16, 17].

Ферментативные активности. В табл. 2 приведены результаты анализа активностей ферментов в тех же образцах ядовитого секрета восточной степной гадюки.

Таблица 2. Активности ферментов в ядовитом секрете V. renardi

	n	Протеазы, мкг тирозина / мг белка мин		t ф P	Оксидаза L-аминокислот, Е / мг белка мин		t ф P
		M ± m	lim		M ± m	lim
самки	7	80,5±4,46	64,1-94,3	0,955	12,3±2,49	5,7-26,2	0,244
самцы	13	75,2±3,29	43,9-89,2	>0,05	11,2±3,00	0,0-31,0	>0,05
самцы (желтый яд)	9	72,0±4,08	43,9-84,7	1,554 >0,05	16,1±3,08	2,9-31,0	3,648 <0,01
самцы (бесцветный яд)	4	82,5±4,00	71,9-89,2		0,0	0,0
взрослые	20	77,1±2,64	43,9-94,3	5,441	11,6±2,09	0,0-31,0	4,949
новорожденные	16	109,3±5,75	71,2-173,6	<0,001	0,0	0,0	<0,001

Примечания: n - количество образцов яда, использованных для определения активностей ферментов; жирным шрифтом выделены выявленные статистически значимые различия

Результаты сравнения выборочных средних значений активности ферментов позволяют сделать ряд выводов.

Во-первых, в ядовитом секрете самцов и самок не было обнаружено статистически значимых различий ни в активности протеолитических ферментов ( t ф =0,955, P >0,05), ни в активности оксидазы L-аминокислот ( t ф =0,244, P >0,05). Отсутствие половых различий в активности ферментов яда отмечено ранее и в популяциях обыкновенной гадюки [3].

Во-вторых, у самцов образцы желтого и бесцветного яда не различались по активности протеаз ( t ф =1,554, Р >0,05), но статистически значимо различались активностью оксидазы L-аминокислот ( t ф =3,648, P <0,01). Желтые образцы имеют более высокую активность оксидазы L-аминокислот. У гадюки Ренара различия в ее активности обнаруживаются и между желтым ядом у самок и бесцветным ядом у самцов ( t ф =3,400, P <0,01), в то время как между желтым ядом самцов и желтым ядом самок аналогичные различия не выявлены ( t ф =0,918, P >0,05). Более высокая активность данного фермента в желтом яде по сравнению с бесцветным установлена нами ранее и для обыкновенной гадюки [3].

В-третьих, отмечены различия в яде взрослых особей и новорожденных - протеолитическая активность новорожденных гадюк статистически значимо выше (tф=5,441; P<0,001). Здесь же отметим, что все исследованные образцы яда новорожденных были бесцветными с нулевой активностью оксидазы L-аминокислот. В то же время, в выборке взрослых особей (20 экз.) превалировал желтый ядовитый секрет, и лишь у четырех самцов (20%) яд был бесцветным. Ранее было отмечено, что у ядовитых змей рода Crotalus актив ность оксидазы L-аминокислот в яде увеличивается с возрастом и размерами змеи [15].

У 16 гадючат из помета одной самки мы определили активности протеаз и оксидазы L-аминокислот (табл. 2). Средние значения активности обоих ферментов в яде новорожденных статистически значимо отличаются от такового у взрослых особей на самом высоком уровне значимости. Протеолитическая активность молодых выше, а активность оксидазы L-аминокислот ниже по сравнению с взрослыми гадюками.

Для новорожденных из шести других пометов активности ферментов определены в объединенных образцах яда, т.е. собранного вместе от всех гадючат в помете. Лимиты значений протеолитической активности составили 88,0-158,6 мкг тиро-зина/мг белка в мин при среднем значении 112,7±10,13 мкг тирозина/мг белка в мин. Эти значения практически совпадают с таковыми, полученными при анализе индивидуальных образцов яда 16 новорожденных из одного помета (табл. 2). Причины выявленных возрастных различий в активности ферментов нам пока неизвестны.

Таким образом, у взрослых особей гадюки Ренара из Камышинского района Волгоградской области статистически значимых половых различий не удалось выявить ни в токсичности, ни в активности ферментов ядовитого секрета. Обнаружено, что яд взрослых особей и новорожденных гадюк различается как по значению ЛД50, так и по активности ферментов: ядовитый секрет новорожденных гадюк является более токсичным для сверчков, чем яд взрослых особей, и в нем отмечена более высокая активность протеолитических ферментов. В то же время, в яде новорожденных гадюк полностью отсутствовала активность оксидазы L-аминокислот. Исследованию возрастных различий в свойствах ядовитого секрета гадюк мы планируем в дальнейшем уделить более пристальное внимание.