Особенности экспрессии BDNF в головном мозге крыс при экспериментальном моделировании сахарного диабета I типа

Funding : the work was carried out with the financial support of the RSF grant No. 21-15-00192.

Сахарный диабет (СД), характеризующийся высокой заболеваемостью и смертностью, является серьезной проблемой здравоохранения во всем мире.

Результирующим действием хронической гипергликемии на организм пациентов является развитие осложнений, сопровождающихся повреждением, дисфункци-

ей и недостаточностью со стороны различных органов: кровеносных сосудов, сердца, почек, органов желудочно-кишечного тракта, а также периферической (ПНС) и центральной нервной системы (ЦНС). В настоящее время любое когнитивное расстройство: тревога, потеря памяти, депрессия, деменция, а также болезнь Альцгеймера, возникшие на фоне СД, при отсутствии других предрасполагающих факторов, рассматривается как диабетическая энцефалопатия (ДЭ). Гипергликемия провоцирует ряд механизмов, которые, как считается, лежат в основе ДЭ, включая апоптоз нейронов, окислительный стресс, нейровоспаление и измененный нейрогенез, гипер-лептинемию, повышение уровня глюкокортикоидов, митохондриальую дисфункцию и т. д. [1, 2]

Нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) представляет собой белок, участвующий в регуляции нескольких процессов, включая нейропластичность, нейровоспаление, нейрогенез и дифференцировку нейронов, и связан с рядом неврологических и психиатрических расстройств [3–5]. Обнаружен низкий уровень BDNF и развитие когнитивного дефицита при СД. Предполагается, что снижение уровня BDNF может нарушать метаболизм глюкозы и способствовать проггрессированию СД и его осложнений [4].

Показано, что когнитивный дефицит у мышей при СД снижается при лечении производными адамантана, что приводит к возрастанию экспрессии GLP-1-глюкагоноподобного пептида, а также генов BDNF, Cav1 в головном мозге и центральной блокаде провоспалительного синтеза цитокинов [6].

Кроме того, до настоящего времени, остаются малоизученным вопрос об особенностях иммуногистохимической экспрессии BDNF в различных отделах головного мозга при диабетической энцефалопатии и сопряженности данной экспрессии с характером и степенью нейродегенеративных изменений.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Анализ корреляции между характером и степенью патоморфологических изменений и экспрессией BDNF в различных отделах головного мозга при экспериментальном воспроизведении стрептозотоци-ниндуцированного СД.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальное исследование проведено на 30 белых беспородных лабораторных крысах-самках в возрасте 12 месяцев. Моделирование стрептозотоци-ниндуцированного СД длительностью 6 месяцев проводили по ранее описанной методике [7]. В качестве позитивного контроля использовали крыс без СД (интактных) той же партии животных. Забор тканей головного мозга проводили у наркотизированных (хлоралгидрат, 400 мг/кг, внутрибрюшинно) животных.

Материал фиксировали в 10%-м нейтральном формалине, с дальнейшим обезвоживанием в бата- рее спиртов и изготовлением парафиновых блоков. Срезы толщиной 5–7 мкм окрашивали тионином по методу Ниссля. Исследовали признаки повреждения в высокочувствительных к различным повреждающим факторам популяциях клеток ганглионарного слоя коры и пирамидных нейронов гиппокампа (поля СА1, СА3).

Выявление мозгового нейротрофического фактора (BDNF) проводили с помощью иммуногистохимического исследования с использованием первичных антител к белку BDNF (нейротрофический фактор мозга; англ. brain-derived neurotrophic factor) в соответствии с инструкциями производителя (разведение 1 : 100) (Affinity Biosciences, China) и визуализирующей полимерной системы детекции Гистофайн – N-Histofine® Simple Stain MAX PO (MULTI) (Nichirei Nichirei Biosciences INC., Japan). Срезы докрашивали гематоксилином. Интенсивность экспрессии BDNF на срезах оценивали с помощью программы анализа изображений ImageJ 1.54d. Определяли относительную площадь, занимаемую иммунопози-тивным материалом в поле зрения микроскопа. Фотодокументирование осуществляли цифровой фотокамерой Olympus (Япония). Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ Statistica 6,0 (StatSoft, USA). Различия между группами оценивали по критерию Манна – Уитни (Mann – Whitney, U -test) и считали статистически значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В серии экспериментов по моделированию стреп-тозотоцининдуцированного СД структурные изменения носили неоднородный характер в различных структурах головного мозга и значительно варьировали от животного к животному. В гиппокампе среди нейронов пирамидного слоя СА1 поля у крыс с экспериментальным СД обнаружены единичные гиперхромные клетки (табл. 1).

В СА3 гиппокампа визуализировалось значительное количество сморщенных нейронов с гиперх-роматозом цитоплазмы перикарионов.

Обнаруживались также единичные сморщенные нейроны с резко выраженной базофилией цитоплазмы перикарионов и пикнотичным ядром. При морфометрическом анализе отмечена тенденция к увеличению количества поврежденных нейронов. Относительная плотность гиперхромных нейронов с дистрофическими изменениями в группе животных с экспериментальным СД составляла (10,19 ± 4,09) %, в группе контрольных крыс данный показатель составил (2,38 ± 0,75) % (при p > 0,05).

Из всех функциональных отделов церебральной коры патоморфологические изменения наблюдалось, в основном, в моторных, соматосенсорных и аудиторных областях коры. Обращает на себя внимание тот факт, что дистрофический процесс затрагивал преимущественно крупные клетки ганглионарного слоя. Преобладали гиперхромные изменения, характеризующиеся уменьшением объема и деформацией клеточных тел. Отмечалось усиление базофилии цитоплазмы, при этом глыбки базофильного материала локализовались перинуклеарно или по периферии перикариона.

Ядра также деформировались и уменьшались в объеме. Часть клеток характеризовались выраженной гиперхромией и гомогенизацией цитоплазмы с невозможностью визуализации ядерного материала. В некоторых нейронах данные изменения сочетались с появлением внутрицитоплазматических вакуолей.

По данным морфометрического исследования, достоверное увеличение поврежденных нейронов фиксировалось во всех исследуемых отделах неокор-текса, однако наиболее выраженные дистрофические изменения фиксировались в моторных и соматосенсорных отделах неокортекса (см. табл.).

Относительная численная плотность поврежденных нейронов в различных отделах головного мозга ( M ± m ) %

Структуры головного мозга	Степень патоморфологических изменений нейронов	Интакт	СД
CA1 поле гиппокампа	НН	96,42 ± 0,63	96,48 ± 0,48
	СН	3,25 ± 0,39	2,98 ± 0,40
	ГН	0,32 ± 0,32	0,55 ± 0,37
CA3 поле гиппокампа	НН	97,62 ± 0,75	89,81 ± 4,09
	СН	1,99 ± 0,57	2,54 ± 0,25
	ГН	0,39 ± 0,39	7,65 ± 4,05
Моторная кора	НН	98,14 ± 0,63	85,16 ± 2,35 *
	СН	1,59 ± 0,52	6,78 ± 2,26 *
	ГН	0,28 ± 0,28	8,06 ± 2,01 *
Соматосенсорная кора	НН	97,65 ± 0,69	68,10 ± 4,47 *
	СН	2,11 ± 0,64	7,20 ± 1,97 *
	ГН	0,25 ± 0,25	24,70 ± 3,86 *
Аудиторная кора	НН	97,70 ± 0,85	89,47 ± 1,36 *
	СН	2,01 ± 0,78	5,83 ± 4,24 *
	ГН	0,29 ± 0,29	4,70 ± 1,24 *

Примечания: * - показатели статистически значимо отличаются от группы Интакт при р < 0,05; Критерий Манна - Уитни. Степень поражения нейронов [Чубинидзе А. И., 1972]: нейроны нормальные, неизмененные (НН); слабоизменен-ные нейроны (СН) с сохранением ядра, но со структурными или тинкториальными нарушениями компонентов цитоплазмы (набухание, гиперхроматоз, хроматолиз, центральная тинкториальная ацидофилия); грубо измененные нейроны (ГН) -выраженное сморщивание, «тяжелое изменение», гомогенизирующее изменение нейронов, клетки-тени.

У интактных животных нейротрофический фактор выявлялся преимущественно в цитоплазме нейронов и клеток глии, а также эндотелии средних и крупных сосудов. Иммунопозитивное окрашивание носило неоднородный характер: преобладали клетки с умеренной экспрессией белка в цитоплазме, однако, в единичных случаях обнаруживались интенсивно окрашенные клетки (рис. 1).

У экспериментальных животных со стрептозото-цининдуцированном СД иммуногостохимическое исследование продемонстрировало достоверное снижение относительной площади иммунопозитивного материала как в полях гиппокампа, так и различных функциональных отделах церебральной коры (рис. 2).

В СА1 поле гиппокампа фиксировалось преимущественно уменьшение концентрации BDNF в цитоплазме клеток без значимых признаков повреждения нейронов.

По сравнению с интактными крысами увеличивалось количество слабо позитивных и BDNF-негативных нейронов. В СА3 поле и исследуемых отделах неокортекса сохранялась данная тенденция, но дополнительно отмечалось выраженное снижение экс- прессии нейротрофического фактора в клетках с признаками повреждения различной степени выраженности (рис. 1).

Таким образом, результаты проведенной нами работы позволили выявить сопряженность снижения уровня экспрессии BDNF cо степенью нейродегене-ративных изменений в коре головного мозга крыс при экспериментальном моделировании СД I типа.

Стоит отметить тот факт, что при экспериментальной диабетической энцефалопатии, экспрессия нейротрофического фактора начинала снижаться даже в отсутствие видимых патоморфологических изменений в нейронах и в клетках глии, что наблюдалось нами в СА1 поле гиппокампа. При этом, дефицит нейротрофина продолжал нарастать по мере развития дистрофических изменений, за счет резкого снижения экспрессии BDNF в цитоплазме поврежденных клеток (СА3 поле гиппокампа, церебральная кора), что позволяет рассматривать развитие когнитивных нарушений и признаков атрофических и обратимых изменений в нейронах коры головного мозга при СД в контексте снижения нейропротекторного влияния BDNF [8, 9].

Рис. 1. Снижение экспрессии BDNF в структурах головного мозга при экспериментальной диабетической энцефалопатии: А – СА1 поле гиппокмпа; Б – СА3 поле гиппокмпа; В – Моторная кора. Г – Аудиторная кора. Иммуногистохимическое исследование, антитела против BDNF, докраска гематоксилином. Увеличение x400.

Рис. 2. Относительная площадь экспрессии BDNF в различных функциональных отделах головного мозга при моделировании СД M ± m %. СА1- СА1 поле гиппокампа; СА3- СА3 поле гиппокампа; МК – моторная кора; ССК – соматосенсорная кора;

АК – аудиторная кора

Примечание. * – показатели статистически значимо отличаются от группы интакт при р < 0,05; Критерий Манна – Уитни.

Кроме того, данное исследование свидетельствует о том, что иммуногистохимическое определение экспрессии BDNF в структурах головного мозга является чрезвычайно чувствительным методом, выявляющим морфофункциональные изменения нейронов и клеток глии на самых ранних стадиях ДЭ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, морфологические изменения в головном мозге при экспериментальном моделировании диабетической энцефалопатии характеризуются снижением цитоплазматической экспрессии белка BDNF в моторных, соматосенсорных, аудиторных областях коры головного мозга и в СА1, СА3 полях гиппокампа в нейронах с признаками обратимых изменений, а также в нейронах без значимых патоморфологиче-ских признаков повреждения, что, по-видимому, способствует снижению устойчивости нейронов неокортек-са и архикортекса к повреждению при СД.

Нейропротективное влияние BDNF может быть связано с его противовоспалительным, регенераторным, а также антиапоптотическим свойствами [3, 10, 11], делает актуальным поиск путей сохранения и/или стимуляции продукции BDNF для патогенетически обоснованной нейропротекции при СД и его осложнениях.