Особенности экспрессии CD133 и CD44 маркеров опухолевых стволовых клеток при метастатическом и неметастатическом раке желудка

В разных опухолях ОСК экспрессируют различные маркеры и их комбинации, которые выявляются также на нормальных стволовых клетках или клетках-предшественницах, элементах стромы опухоли или опухолевых клетках, не имеющих свойств стволовых, поэтому, возможно, только часть клеток, выбранных по их экспрессии, является ОСК. К настоящему моменту окончательно не решен вопрос о стабильности фенотипа ОСК в процессе прогрессирования опухоли или при переходе из систем in vivo к in vitro. Кроме того, разные подтипы опухолей одного органа могут иметь ОСК, экспрессирующие разные маркеры [5].

Для исследования осуществляли забор операционного материала, в котором производились несколько параллельных горизонтальных разрезов через всю опухоль. При этом избегали очагов некроза, так как для исследования были необходимы образцы визуально сохранной опухоли. Для фиксации материала использовали раствор 10 % нейтрального забуференного формалина с последующей стандартной проводкой дегидратантами; в конце образцы заключали в парафин. Приготавливали срезы толщиной 3–5 мкм с последующим окрашиванием гематоксилином и эозином.

Иммуногистохимическое исследование проводили на срезах с парафиновых блоков опухолей, предназначенных для стандартного морфологического исследования. Парафиновые срезы депарафинировали и регидратировали по стандартной методике. «Демаскировку» антигенов проводили в PT-LinkThermo.

Для определения экспрессии CD44 и CD133 на опухолевых клетках иммуногистохимическим методом использовали моноклональные мышиные антитела к CD44 клон 156-3С11 (Thermo Scientific) в разведении 1:2500 и поликлональные кроличьи антитела к CD133 (Cloud-Clone Corp.) в разведении 1:700 с использованием автостейнера Thermo Scientific; для демаскировки антигена CD133 применяли буфер 10 мМTris, 1 мМEDTA (рН 9,0), для CD44 – аналогичный буфер рН 6,0.

Оценивали мембранную окраску в 10 % и более всех опухолевых клеток; характеризовали интенсивность окрашивания клеточной мембраны: 0, + – слабое, ++ – умеренное, +++ – сильное окрашивание. При наличии интенсивности окрашивания ++ и +++ случай рассматривался как позитивный. Экспрессия белка CD44 имеет мембранную локализацию и определялась как положительная, когда окрашивание было выявлено в 10 % (cut-off) и более всех опухолевых клеток. Белок CD133 также имеет мембранную локализацию; его экспрессию считали положительной, когда окрашивание было выявлено в более 5 % всей опухоли. На рис. 1 и 2 представлены примеры результатов ИГХ окрашивания препаратов при РЖ для выявления CD44+- и CD133+-клеток.

Результаты измерений количественных показателей представлены в виде X ± m, где X – среднее значение, m – среднеквадратичное отклонение. Проверка на нормальность закона распределения показателей проводилась с использованием критерия Шапиро–Уилка. Для сравнения средних значений количественных показателей в группах, в случае нормального закона распределения, использовали параметрический критерий Стьюдента, в противном случае – непараметрический критерий Манна–Уитни. Для анализа связи между факторным и результативным признаками использовался критерий χ2 Пирсона. Различия считали статистически значимыми при р≤0,05.

Результаты

В нашем исследовании позитивная экспрессия CD44+ в клетках опухоли пациентов без метастазов выявлена в 4 (20 %), в то время как при метастатическом РЖ – в 13 (65 %) случаях. Следует отметить, что в группе с метастазами разброс позитивно-окрашенных клеток по экспрессии CD44 находился в пределах от 9 до 15 %, в среднем составив 10,0 ± 3,08 %, тогда как в группе без метастазов – этот показатель варьировал от 1 до 13 %, где средние значения CD44+ клеток составили 6,0 ± 2,3 %. В результате сравнения были отмечены статистически значимые по критерию χ2 различия в исследуемых группах – 8,256 при р=0,004.

При исследовании экспрессии CD133 установлено, что положительная реакция CD133 в клетках опухоли у больных с диссеминированным РЖ наблюдалась в 19 (95 %), тогда как при локализованном РЖ – в 16 (80 %) случаях. Разброс положительно окрашенных клеток в группе с метастазами был значительный и составлял от 10 до 40 %, в среднем – 21,3 ± 11,6 %, а в группе без метастазов – от 1 до 14 %, составив в среднем 10,0 ± 2,4 %. В результате были отмечены статистически значимые по критерию χ2 различия в сравниваемых группах – 4,444 при р=0,036.

Обсуждение

Несмотря на то, что до настоящего времени нет однозначных маркеров, позволяющих идентифицировать ОСК, в современных исследованиях накоплен опыт, подтвержающий целесообразность определения экспрессии ряда молекул, указывающих на наличие уникальных свойств данной группы клеток в гетерогенной опухолевой популяции. В качестве данных маркеров наиболее часто выступают такие молекулы, как CD44 и CD133.

Рис. 1. Экспрессия CD44 маркера в препарате опухоли при РЖ:

B – positive expression of CD133 (2+) in tumor cells in GC. C – positive expression of CD133 (3+) in tumor cells in GC. ×400

Рядом авторов показаны антиапоптотические и прометастатические эффекты активации СD44. Влияя на интенсивность деградации гиалуроновой кислоты и определяя расположение на мембране матрикс-модифицирующих ферментов, СD44 может участвовать в моделировании опухолевого микроокружения, а его расщепление, которое отмечалось в ткани опухоли, способствует увеличению миграционной активности клеток [8, 9].

Функциональная роль увеличения количества CD44+-клеток в ткани опухоли с учетом факта различной её выраженности при различных формах злокачественных новообразований требует дальнейшего изучения. Но, вероятно, участвуя во взаимодействии с различными компонентами межклеточного матрикса, CD44 определяет адгезивные свойства клеток, их чувствительность к различным регуляторным факторам, а все это будет определенным образом влиять на формирование метастатического фенотипа опухолевых клеток.

Представляет особый интерес определение экспрессии CD44 маркера в региональных и отдаленных метастатических очагах у больных РЖ, так как в доступной литературе данный вопрос мало изучен. В проведенных нами исследованиях по определению данного маркера в опухолях и метастазах при колоректальном раке было показано, что экспрессия CD44 в опухолях, дающих отдаленные метастазы, выше в клетках первичной опухоли, чем в клетках метастазов [10].

Полученные нами результаты по экспрессии CD44 согласуются с данными некоторых авторов. В частности, в работе A. Afify et al. отмечается снижение экспрессии CD44 маркера в большинстве метастатических опухолей. Показано, что в 65 % случаев метастазов аденокарцином в лимфатические узлы отсутствует экспрессия CD44, в то время как в 92 % случаев первичной опухоли она выявляется [11].

Противоречивые данные получены относительно роли CD44 в прогрессировании опухоли и образовании метастазов при раке толстой кишки [12, 13]. Снижение экспрессии CD44, по одним данным, коррелирует с уменьшением метастатического потенциала клеток КРР [14], по другим – это приводит к увеличению метастатического и миграционного потенциалов [15]. Низкодифференцированные опухоли толстой кишки имеют более высокий уровень экспрессии CD44 по сравнению с высокодифференцированными, и сверхэкспрессия этого маркера ассоциирована с уменьшением выживаемости у пациентов [16].

Другим маркером ОСК наиболее часто выступает CD133 (АС133, проминин-1) – гликопротеин с пятью трансмембранными доменами молекулярной массой 120 кД, взаимодействующий с холестеролом [17], имеет 3 изоформы: CD133-1, CD133-2, CD133-3. Молекула ассоциирована с мембранными выпячиваниями, но её функция точно не известна.

Заключение