Особенности электронно-микроскопической визуализации мягких наночастиц на основе фосфолипидов

Липиды в водном окружении способны формировать разнообразные наноструктуры: сферические и цилиндрические мицеллы, планарные ламеллярные структуры (бислои) и замкнутые (липосомы), инвертированную гексагональную фазу [1, 2]. Это свойство липидов находит широкое применение в биотехнологии и медицине, в частности, наночастицы на основе липидов используют в качестве носителя лекарственных препаратов [3–5]. Рациональный дизайн и синтез систем доставки препаратов на основе липидов требует контроля их структурной организации на протяжении всего процесса их сборки. Одним из способов такого контроля является визуализация липидных частиц, контрастированных солями тяжелых металлов, с помощью просвечивающей электронной микроскопии.

Метод негативного контрастирования был разработан для электронно-микроскопического исследования суспензий вирусных частиц, в дальнейшем он стал основным методом визуализации наноструктур различной природы, в том числе липидных [4, 6]. Целью данной работы являлось изучение особенностей электронно-микроскопической визуализации мягких наночастиц, на основе смесей (1) диолеилфосфа-тидилэтаноламина (DOPE) и фосфатидиловой кислоты (PA), и (2) фосфатидилхолина (PC) и холестерина с помощью различных контрастирующих веществ.

Материалы и методы

Диолеилфосфатидилэтаноламин (DOPE), яичная фосфатидиловая кислота (PA), яичный фосфатидилхолин (PC) (Avanti Polar Lipids, США); холестерин (Сhоl) (Alfa Aesar, США); дейтерированная вода для ЯМР анализа (Аст-рахим, Россия); хлороформ (Реахим, Россия); метанол (Вектон, Россия). Фосфолипиды были растворены в смеси хлороформ/метанол (1:1), а холестерин – в хлороформе, до конечной концентрации 1 мМ; уранилацетат (Fluka, США), фосфорновольфрамовая кислота (Fluka, США), формвар (SPI-СНЕМТМ, США), разведенный в дихлорэтане (Fluka, США).

Получение мягких наночастиц на основе фосфолипидов

Мягкие наночастицы на основе фосфолипидов получали гидратацией тонкой липидной пленки с последующей обработкой ультразвуком. В круглодонной колбе смешали растворы: DOPE (900 µл, 1 мМ) и PA (200 µл, 1 мМ), – смесь липидов 1; PC (500 µл, 1 мМ) и Chol

(500 µл, 1 мМ), – смесь липидов 2. Полученные смеси были упарены на ротационном испарителе, после отгонки органических растворителей липидные пленки дополнительно сушили в вакууме в течение 30 мин. К сформированным на дне колб липидным пленкам прилили по 750 µл дейтерированной воды, гидратацию пленок вели 30 мин при интенсивном перемешивании и комнатной температуре. После гидратации полученные растворы были обработаны ультразвуком в течение 15 мин при комнатной температуре и максимальной мощности ультразвука 230W.

Электронная микроскопия

Препараты суспензий мягких наночастиц были приготовлены одновременно, в течение первых суток после их синтеза. Суспензии сорбировали в течение 1 мин на медную сетку (300 ячеек), покрытую формваровой подложкой, стабилизированной углеродом, избыток жидкости оттягивали фильтровальной бумагой. Затем сетку помещали на каплю контрастирующего вещества: уранила ацетата (УА) на 10 с, фосфорновольфрамовой кислоты (ФВК, рН 0,5) на 5 с или ФВК (рН 7,0) на 10 с. Избыток контрастирующего вещества оттягивали фильтровальной бумагой.

Препараты изучали в просвечивающем электронном микроскопе Jem-1400 (Jeol, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Снимки получали с помощью цифровой камеры бокового ввода Veleta (Olympus Corporation, Япония). Измерения проводили непосредственно на экране камеры с помощью пакета программ iТЕМ (Olympus Corporation, Япония).

31Р-ЯМР исследование раствора мягких наночастиц на основе фосфолипидов

Спектры31 P-ЯМР регистрировали на спектрометре AV-300 (Bruker, Германия). Химические сдвиги в спектрах приведены в миллионных долях относительно сигнала 85 %-ной ортофосфорной кислоты (внешний стандарт). ЯМР исследование было выполнено в химическом сервисном ЦКП НИОХ СО РАН (Новосибирск, Россия).

Результаты и обсуждение

Исследование препарата липидных частиц состава DOPE/PA

В препарате при всех типах контрастирования выявляются многочисленные частицы разных размеров и формы, расположенные на сеточке в основном поодиночке (рисунок 1) .

Контрастирование препарата липидных частиц состава DOPE/PA уранила ацетатом выявляет округлые частицы с четкой границей, на поверхности которых встречаются вдавле-ния (рисунок 1 А-Б). Частицы состоят из нитей низкой электронной плотности, в расположении которых прослеживаются признаки организации. Данная структура свидетельствует о том, что липиды частиц находятся в инвертированной гексагональной фазе.

Контрастирование этого же препарата ФВК (рН 0,5) также выявило частицы округлой формы с четкой границей, состоящие из нитей (рисунок 1 В-Г), диаметром 2–3 нм, что соответствует диаметру структур, характерных для инвертированной гексагональной фазы изучаемых липидов. Контрастирующий реагент ФВК (рН 0,5) глубже проникает в промежутки между нитями в частице, чем УА, вследствие чего структура нитей выявляется более четко.

Контрастирование препарата ФВК (рН 7,0) заметно меняет вид липидных частиц, формирующие их нити выглядят более плотными и протяженными, хотя их диаметр не изменяется (рисунок 1 Д-З). Очевидно, промежутки между нитями становятся шире вследствие заполнения контрастирующим веществом. Таким образом, контрастирование препарата смеси липидов DOPE/PA с помощью ФВК (рН 7,0) приводит к структуризации нитей и появлению мембранно-подобных структур, которые могут создать ложное впечатление того, что липиды смеси находятся в ламеллярной фазе. Для точного определения фазы липидов было проведено исследование образца методом ЯМР.

Исследование типа фазового состояния смеси липидов проводили методом ЯМР спектроскопии на ядрах³¹ Р. Согласно данным³¹ Р-ЯМР в спектре образца, который содержит частицы состава DOPE/PA (9:2), присутствует один сигнал на 0,189 м.д. (рисунок 1 И). На спектре видно, что пик имеет плечо в слабом поле, что согласно литературным данным соответствует инвертированной гексагональной фазе [7].

Исследование препарата липидных частиц состава PC/Chol

В препарате при контрастировании всеми веществами наблюдаются скопления многочисленных полиморфных частиц разного размера (рисунок 2) , отдельно лежащие частицы встречаются редко.

Контрастирование УА выявляет рыхлые скопления частиц неправильной формы, имеющих четкую границу и рельефную поверхность. Частицы образованы хаотично расположенными тонкими нитями низкой электронной плотности (рисунок 2 А, Б), по морфологическим параметрам данные структуры можно отнести к липидам, находящимся в инвертированной гексагональной фазе. Между нитями отмечаются полости различной формы, видимые как структуры средней электронной плотности.

В зависимости от величины рН контрастирующего раствора ФВК, в образцах наблюдаются рыхлые скопления частиц (рН 0,5), либо плотные скопления, в которых границы между частицами плохо визуализируются (рН 7,0) (рисунок 2 В-Е).

Частицы образованы тонкими нитями низкой электронной плотности, диаметром около 2 нм (рисунок 2 В-Е), что соответствует липидам в гексагональной фазе (контрастирование ФВК). Нити достаточно плотно «упакованы» внутри этих частиц, которые часто окружены стопками липидных бислоев, последние выглядят как чередование электронно-прозрачных (~ 2–3 нм) полос и полос средней электронной плотности (~ 1,3–1,6 нм), их толщина одинакова на всем протяжении и не зависит от величины рН ФВК. Такие стопки, по всей видимости, соответствуют ламеллярной фазе липидов. Они могут закручиваться в кольца различного диаметра или располагаться прямыми участками разной длины. При контрастировании ФВК (рН 0,5 и 7,0) в частицах выявляются такие же полости, как при контрастировании УА, однако, они имеют более четкую структуру.

Таким образом, контрастирование ФВК (рН 0,5 и рН 7,0) выявило в частицах состава PC/Chol присутствие липидов как в ламеллярной, так и в гексагональной фазе, что подтверждается исследованием данного препарата методом ЯМР. Анализ спектров ЯМР показал, что липидный состав PC/Chol (1:1) в полученных частицах имеет несколько фазовых состояний. На спектре выделяется три сигнала на -0,235, -0,362 и -0,482 м.д. (рисунок 2 Ж). Сигнал имеет плечо в сильном поле (обозначено стрелкой), что свидетельствует о наличии ламелярной фазы, которой соответствует пик на -0,482 м.д. [7]. Пики на -0,235, -0,362 м.д. можно отнести к инвертированной гексагональной и изотропной (мицеллярная, инвертированная мицеллярная и кубическая) фазам, подобное поведение данной смеси липидов было описано ранее [8].

Рисунок 1. Липидные частицы состава DOPE/PA. Контрастирование: А, Б – уранила ацетатом; В, Г – ФВК рН 0,5; Д-З – ФВК рН 7,0. Длина масштабной линии соответствует 50 нм. И-К – 31Р-ЯМР спектр липидных частиц.

Figure 1. Lipid particles having a composition of DOPE/PA. Contrasting with: A, B – uranyl acetate; C, D – PTA (рН 0.5), E-H – PTA (рН 7.0). Scale bars correspond to 50 nm. I-G – 31Р-NMR spectrum of lipid particles.

в

Рисунок 2. Липидные частицы состава PC/Chol. Контрастирование: А, Б – уранила ацетатом; В, Г – ФВК рН 0,5; Д, Е – ФВК рН 7,0. Е, врезка – стопка бислоев. Стрелками показаны полости в частицах. Длина масштабной линии соответствует 50 нм. Ж – 31Р-ЯМР спектр липидных частиц.

Figure 2. Lipid particles having a composition of PC/Chol. Contrasting with: A, B – uranyl acetate; C, D – PTA (рН 0.5), E, F – PTA (рН 7.0). Scale bars correspond to 50 nm. G – 31Р-NMR spectrum of lipid particles.

Заключение

Метод негативного контрастирования предполагает создание электронно-плотного фона солями тяжелых металлов (контрастирующими веществами), на котором видны биологические объекты, состоящие из легких атомов и, соответственно, имеющие низкую электронную плотность [9]. Электронно-микроскопическое изучение наноструктур, содержащих органические молекулы, показало, что контрастирующие вещества могут активно взаимодействовать с объектом исследования, несмотря на адсорбцию последнего на пленке и короткий (5–10 с) период контакта объекта и контрастирующего реагента [10]. Проведенное нами исследование