Особенности клеточного и гуморального механизмов местного воспаления при ХОБЛ различной степени тяжести

Хроническая обструктивная болезнь легких – одно из наиболее распространенных заболеваний современного общества. Особенностью ХОБЛ является неуклонно прогрессирующая обструкция дыхательных путей, связанная с патологическим воспалительным ответом на повреждающие частицы или газы. Основная локализация воспаления при ХОБЛ – малые дыхательные пути, но активное воспаление присутствует также в крупных бронхах, в легочной паренхиме и в легочных сосудах [6]. Одним из основных факторов, провоцирующих развитие ХОБЛ, является курение. Табачный дым активирует макрофаги, нейтрофилы, Т-лимфоциты и эпителиальные клетки дыхательных путей и альвеол, что приводит к мощному синтезу и выбросу провоспалительных медиаторов, прежде всего цитокинов.

Цель настоящего исследования состояла в изучении и анализе клеточных и гуморальных механизмов локального воспаления у больных с различными степенями тяжести ХОБЛ и определении возможного влияния глюкокортикостероидной терапии на активность воспалительного процесса.

Задачи исследования:

• 1.    Изучить цитологический состав мокроты и смывов из бронхов у больных ХОБЛ различной степени тяжести.

• 2.    Определить уровень цитокинов (TNFa, IL-8, IL-10) в мокроте и смывах из бронхов у больных ХОБЛ различной степени тяжести.

• 3.    Проанализировать влияние ингаляционных глюкокортикостероидов (иГКС) на активность воспалительного процесса в бронхах у больных ХОБЛ.

4. Сравнить информативность мокроты и смывов из бронхов при изучении местного воспалительного процесса при ХОБЛ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В клинике госпитальной терапии СПбГМУ им. академика И. П. Павлова было обследовано 112 пациентов с ХОБЛ различной степени тяжести, из них 83 мужчины и 23 женщины. Диагноз ХОБЛ, степень тяжести и активность течения заболевания устанавливали в соответствии с критериями Глобальной инициативы по хронической обструктивной болезни легких, пересмотра 2011 года (GOLD, 2011). Исходя из руководства по степени тяжести выделено 4 группы пациентов. Первую группу (n = 27) составили пациенты с легкой степенью тяжести ХОБЛ, у которых регистрировалось только изменение индекса Тиффно менее 70 % от должного. Вторая группа – пациенты с ХОБЛ средней степени тяжести (n = 27), у них регистрировалось снижение ОФВ1 менее 80 % от должного, ОФВ1/ФЖЕЛ < 70 %. В третью группу (n = 33) вошли больные с ОФВ1 ≤ 50 %, но более 30 % от должного (тяжелая степень тяжести ХОБЛ). К четвертой группе (n = 25) отнесены пациенты с крайне тяжелым течением ХОБЛ (ОФВ1 < 30 %). Критериями исключения из исследования были дыхательные нарушения при рецидивирующих тромбоэмболиях легочной артерии, раке легкого, системных аутоиммунных заболеваниях, тяжелой эндокринной, печеночной и почечной патологии. Средний возраст обследованных составил 61,87 ± 10,7 года. 86 человек

были курильщики со средним стажем курения 25,9 ± 1,8 пачка/лет. У 41 человека имел место контакт с профессиональными вредностями.

Все пациенты были обследованы после прохождения стационарного лечения по поводу обострения ХОБЛ в соответствии с тяжестью течения. После подписания информированного добровольного согласия на медицинское вмешательство проводилось комплексное клиникоинструментальное и лабораторное обследование по плану пульмонологического больного. Дополнительно в мокроте и смывах из бронхов методом иммуноферментного анализа с использованием наборов ООО «Цитокин» СПб определялся уровень TNF-α, IL-8, IL-10. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Статистика 6.0 (StatSoft Inc., США). Критической величиной уровня значимости (р) считали 0,050. Переменные представлены в виде «М ± m», где М – среднее арифметическое, m – среднеквадратичное отклонение (SD).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Дляоценки персистирующего воспалительного процесса в бронхиальном дереве у пациентов ХОБЛ различной степени тяжести выполнялись цитологические исследования спонтанной мокроты и бронхоальвеолярных смывов (табл. 1); в данных биологических жидкостях также определялась концентрация провоспалительных (IL-8, TNF-α) и противовоспалительных (IL-10) цитокинов (табл. 2).

Таблица 1 ронхов больных ХОБЛ различной степени ти (%)

Клеточный состав мокроты и смывов из б тяжес

Степень тяжести ХОБЛ	Мокрота				Смывы из бронхов
	Макрофаги	Нейтрофилы	Лимфоциты	Эозинофилы	Макрофаги	Нейтрофилы	Лимфоциты	Эозинофилы
Легкая (n = 27)	23,72* ± 2,54	40,56** ± 3,34	10,2 ± 0,73	14,56 ± 2,87	26,63** ±2 ,42	29,63** ± 2,83	7,25*** ± 0,81	8,0 ± 1,06
Средняя ( n = 27)	24,17 ± 2,75	56,91 ± 3,93	10,48 ± 0,69	13,52 ± 1,29	27,3 ± 3,12	40,9 ± 5,40	10,6*** ± 1,18	7,3 ± 1,27
Тяжелая (n = 33)	17,25* ± 1,67	51,29 ± 2,98	8,11 ± 0,79	11,79 ± 2,02	21,53 ± 2,87	40,29* ± 3,90	6,76 ± 0,80	10,65 ± 1,05
Крайне тяжелая ( n = 25)	17,16 ± 2,68	51,36** ± 3,30	7,64 ± 0,74	12,52 ± 2,94	17,2** ± 1,81	40,8** ± 4,58	8,2 ± 0,85	9,1 ± 1,4

Примечание. * – p < 0,005 между легкой и тяжелой степенями тяжести ХОБЛ; ** – p < 0,005 между легкой и крайне тяжелой степенями тяжести ХОБЛ; *** – p < 0,005 между легкой и средней степенями тяжести ХОБЛ.

Таблица 2

Уровень IL-8, TNF-α, IL-10 мокроты и смывов из бронхов больных ХОБЛ различной степени тяжести (п г/м л)

Степень тяжести ХОБЛ	Мокрота			Смывы из бронхов
	IL-8	TNF-α	IL-10	IL-8	TNF-α	IL-10
Легкая (n = 27)	1806,39* ± 135,29	9,96 ± 1,55	26,72 ± 3,48	146,75 ± 16,22	4,33 ± 0,97	13,43 ± 0,17
Средняя ( n = 27)	2114,36** ± 96,75	24,06 ± 9,9	22,07 ± 3,21	309,9 ± 31,14	35,7 ± 1,4	3,43 ± 0,62
Тяжелая (n = 33)	1075,13* ± 19,67	13,64 ± 3,41	17,48 ± 7,0	240,02 ± 19,59	15,92 ± 3,09	6,7 ± 0,13
Крайне тяжелая ( n = 25)	1229,65** ± 27,68	15,5 ± 7,53	16,42 ± 6,06	269,4 ± 7,57	4,89 ± 0,3	0,38 ± 0,12

Примечание. * – p < 0,005 между легкой и тяжелой степенями тяжести ХОБЛ; ** – p < 0,005 между средней и крайне тяжелой степенями тяжести ХОБЛ.

По результатам данного исследования выявлено, что во всех биологических жидкостях при легком и среднетяжелом течении ХОБЛ отмечалась выраженная макрофагальная реакция. Уровень макрофагов в мокроте при ХОБЛ легкой степени тяжести (23,72 ± 2,54 %) был достоверно выше, чем при тяжелой степени тяжести (17,25 ± 1,67 %). В смывах из бронхов уровень макрофагов при легкой степени тяжести ХОБЛ также был достоверно выше (26,63 ± 2,42 %), чем при крайне тяжелой ХОБЛ (17,2 ± 1,81 %) (табл. 1).

Обратная динамика выявлена по уровню нейтрофилов. С утяжелением течения ХОБЛ нарастало количество нейтрофилов в мокроте и бронхиальном смыве. В мокроте уровень нейтрофилов при ХОБЛ легкой степени тяжести (40,56 ± 3,34 %) был достоверно ниже такового при крайне тяжелом течении ХОБЛ (51,36 ± 3,30 %). Аналогичная картина наблюдалась в смывах из бронхов с достоверно более высоким уровнем нейтрофилов у больных с крайне тяжелым течением ХОБЛ (40,8 ± 4,58 %) по сравнению с больными ХОБЛ легкой степени тяжести (29,63 ± 2,83 %).

Таким образом, на ранних стадиях течения ХОБЛ преобладает макрофагальная активность, что позволяет предположить ведущую роль этих клеток в развитии воспалительного процесса на начальных стадиях заболевания. В настоящее время альвеолярный макрофаг считается центральной клеткой воспаления и регулятором сложных межклеточных взаимодействий.

При тяжелом и крайне тяжелом течении ХОБЛ в бронхиальном секрете преобладали нейтрофилы. Именно их активность связывают с персистенцией воспаления, ремоделированием и формированием необратимой бронхообструкции [2], [4]. Полученные данные согласуются также с результатами исследований биопсии стенки бронхов при ХОБЛ. Исследование биоптатов бронхов и периферических дыхательных путей больных ХОБЛ показало, что инфильтрация одноядерными клетками, в основном Т-лимфоцитами и макрофагами, преобладает у пациентов с легкой формой заболевания, в то время как у пациентов с тяжелым течением заболевания преобладают нейтрофилы [7].

Кроме того, при изучении цитологического состава мокроты и смывов из бронхов больных ХОБЛ различной степени тяжести было выявлено повышение уровня лимфоцитов и эозинофилов во всех исследуемых группах (табл. 1).

По литературным данным, повышение уровня эозинофилов в мокроте при ХОБЛ регистрируется, как правило, при обострении заболевания. При проведении настоящего исследования пациенты обследовались в фазу затихающего обострения, в связи с чем полученные результаты могут подтверждать роль эозинофилов как фактора риска развития бронхообструкции именно на этапе обострения ХОБЛ [3], [6].

Значение лимфоцитов в патогенезе ХОБЛ в настоящее время активно обсуждается. По литературным данным, лимфоциты являются продуцентами интерферона-γ и могут быть ответственными за выделение TNF-α, который вызывает цитолиз и апоптоз клеток альвеолярного эпителия, что способствует персистенции воспаления [5]. Результаты нашего исследования это подтверждают, так как по данным статистического анализа выявлены достоверные положительные корреляционные связи между уровнем лимфоцитов и TNF-α мокроты (r = 0,29, р = 0,043). Также была выявлена положительная корреляционная связь между количеством лимфоцитов мокроты и десквамированными эпителиальными клетками мокроты (r = 0,36, р = 0,005). Эти данные согласуются с исследованиями А. В. Аверьянова и соавторов, которые обнаружили в мокроте и ла-важной жидкости пациентов с ХОБЛ повышенное число CD8+ Т-лимфоцитов и деструктивно измененных бронхиальных эпителиоцитов [1]. Лимфоциты этого фенотипа могут быть источником цитокинов, провоцирующих бронхиальную деструкцию, или самостоятельно оказывать цитотоксическое действие на клетки дыхательных путей.

Анализ полученных данных обнаружил взаимосвязь уровня лимфоцитов и IL-10 мокроты (r = 0,45, р = 0,034). При тяжелой и крайне тяжелой степенях ХОБЛ уровень IL-10 в мокроте снижался (табл. 2) параллельно со снижением уровня лимфоцитов в сыворотке крови (лимфоциты крови при ХОБЛ легкой и крайне тяжелой степеней тяжести соответственно 22,27 ± 1,65 % и 16,5 ± 1,80 %, p < 0,005) и мокроте (табл. 1). IL-10 является противовоспалительным цитокином, который вырабатывается в ответ на продукцию провоспалительных цитокинов. Снижение уровня лимфоцитов и противовоспалительного цитокина IL-10 в мокроте и смывах из бронхов обследуемых пациентов с тяжелым и крайне тяжелым течением ХОБЛ (табл. 2), вероятно, является следствием проводимой противовоспалительной терапии, включающей ингаляционные и системные глюкокортикостероиды, на этапе обострения заболевания. Учитывая то, что в настоящее время лимфоцитам отводят большую роль в развитии аутоиммунного воспаления при тяжелых степенях ХОБЛ, противовоспалительная (глюкокортикостероидная) терапия принимает все более важное значение в терапии ХОБЛ, о чем свидетельствуют полученные результаты. При сравнении уровня IL-10 у пациентов, получавших и не получавших терапию иГКС, достоверных отличий не получено, то есть, можно предположить, что прием иГКС не влияет на уровень противовоспалительного цитокина IL-10 напрямую, но может оказывать опосредованный эффект через воздействие на провоспалительные цитокины (табл. 2). В то же время снижение уровня IL-10

при тяжелой и крайне тяжелой степенях ХОБЛ может быть связано и с угнетением иммунной противозащитной системы организма [8].

Кроме противовоспалительного цитокина IL-10 из гуморальных маркеров воспаления в мокроте и смывах из бронхов больных ХОБЛ различной степени тяжести оценивался уровень провоспалительных цитокинов IL-8 и TNF-α (табл. 2).

В результате анализа концентрации изучаемых цитокинов в мокроте и смывах из бронхов были выявлены более высокие значения уровня IL-8 в обеих биологических жидкостях при легкой и средней степенях тяжести ХОБЛ, при этом в мокроте концентрация IL-8 при легкой степени тяжести ХОБЛ (1806,36 ± 135,29 пг/мл) была достоверно выше, чем при тяжелом течении ХОБЛ (1075,13 ± 19,67 пг/мл), а уровень IL-8 при средней степени тяжести (2114,36 ± 96,75 пг/мл) был достоверно выше уровня IL-8 при крайне тяжелом течении ХОБЛ (1229,65 ± 27,68 пг/мл) (табл. 2).

При изучении уровня TNF-α в мокроте и смывах из бронхов также было выявлено повышение концентрации данного цитокина во всех исследуемых группах (табл. 2). Наибольшие значения были отмечены при средней степени тяжести ХОБЛ (24,06 ± 9,9 пг/мл для мокроты и 35,7 ± 1,4 пг/мл для смывов из бронхов), что, в свою очередь, соотносится с высокой макрофагальной реакцией при этой степени тяжести, выявленной в результате цитологического анализа мокроты и смывов из бронхов.

Таким образом, высокий уровень IL-8 и TNF-α в мокроте и смывах из бронхов подтверждает высокую активность воспалительного процесса в бронхиальном дереве при всех степенях тяжести ХОБЛ в фазу затихающего обострения. Патогенетическую взаимосвязь местного клеточного и гуморального механизмов воспаления доказывают выявленные корреляционные связи: в процессе статистического анализа обнаружены достоверные положительные корреляционные связи между уровнем нейтрофилов и IL-8 как мокроты (r = 0,43, р = 0,05), так и смывов из бронхов (r = 0,38, р = 0,026).

Анализ взаимосвязей уровня цитокинов с показателями функции внешнего дыхания (ФВД) выявил, что у пациентов с более высокими значениями TNF-α мокроты и IL-8 смывов из бронхов регистрируются более низкие показатели бронхообструкции (ОФВ1%, ПОСвыд.%), что может свидетельствовать об участии данных цитокинов в развитии бронхообструкции у больных ХОБЛ [8], [9].

Следует отметить, что при анализе медикаментозной терапии больных ХОБЛ среди пациентов, страдающих тяжелой и крайне тяжелой степенью тяжести заболевания, число больных, получавших иГКС в средней суточной дозе 1000 мкг в пересчете на бекламетазона дипропионат и тиотропиум бромид (18 мкг в сутки), было значительно больше по сравнению с пациентами легкой и средней степени тяжести ХОБЛ. Например, в группе больных с тяжелым течением заболевания иГКС использовали 78 % пациентов, системные ГКС – 76,8 %, тиотропиум бромид – 56 %, в то время как при средней степени тяжести – 11,5, 28,4 и 28,8 % соответственно. Это может объяснять снижение уровня провоспалительных цитокинов в мокроте и смывах из бронхов у больных с более тяжелым течением ХОБЛ.

Результаты нашего исследования, а также данные о патогенезе ХОБЛ подтверждают рекомендации глюкокортикостероидной терапии уже на этапе средней степени тяжести ХОБЛ, при которой выявлены максимальные значения изучаемых провоспалительных цитокинов и клеток воспаления в мокроте и смывах из бронхов, что в сочетании с бронхолитиками, возможно, позволило бы избежать нарастания необратимой бронхообструкции при тяжелом и крайне тяжелом течении ХОБЛ, а также уменьшить риск развития аутоиммунного процесса.

В результате исследования не получено достоверных различий между уровнем изучаемых цитокинов в мокроте и смывах из бронхов. Выявлены положительные корреляционные связи между уровнем TNF-α мокроты и TNF-α смывов из бронхов (r = 0,85, р = 0,001), IL-8 мокроты и IL-8 смывов из бронхов (r = 0,86, р = 0,001).

ВЫВОДЫ

• 1.    У больных хронической обструктивной болезнью легких легкой и средней степеней тяжести преобладает макрофагальная реакция мокроты и смывов из бронхов, что позволяет предположить ведущую роль макрофага в развитии локального воспалительного процесса в начале развития ХОБЛ.

• 2.    У пациентов с тяжелой и крайне тяжелой ХОБЛ в бронхиальном секрете преобладают нейтрофилы, что подтверждает роль данных клеток в поддержании местного персистирующего воспаления.

• 3.    При всех степенях тяжести выявлен высокий уровень IL-8 и TNF-α, причем при легкой и средней степенях тяжести данные маркеры достоверно выше, чем при тяжелой и крайне тяжелой ХОБЛ, что может говорить о значимости базисной противовоспалительной терапии у данной категории пациентов.

• 4.    Информативность анализа мокроты и смывов из бронхов сопоставима, что позволяет чаще использовать цитологическое исследование мокроты, не прибегая к инвазивным методикам, в том числе для оценки активности местного воспаления.

SPECIFICS OF СELLULAR AND HUMORAL MECHANISMS OF LOCAL INFLAMMATION

IN COPD OF VARYING SEVERITY