Особенности криоконсервации алканотрофных актинобактерий рода Rhodococcus

Практическое использование микроорганизмов в различных областях биотехнологии и медицины напрямую связано с применением эффективных методов поддержания гарантированно стабильных, жизнеспособных культур. Создание таких методов, пригодных для продолжительного хранения микроорганизмов, стало возможным благодаря расшифровке природы обратимой остановки жизнедеятельности клеток при глубоком замораживании и высушивании. Следует однако отметить, что ни один из существующих методов длительного поддержания коллекционных и производственных культур не является универсальным. Для хранения больших коллекций микробных ресурсов наиболее оправдано применение методов глубокого высушивания (лиофилизации) и криоконсервации (Ившина и др., 1994; Gherna, 1994; Каменских, 1998; Цуцаева и др., 2008;). Один из современных способов криоконсервации микроорганизмов – замораживание и хранение бактериальных культур в условиях специализированных морозильников сверхнизких (-85^96°С) температур. Литературные сведения об эффективности данного метода хранения весьма немногочисленны, а подобные исследования в отношении актинобактерий рода Rhodococcus ранее не проводились.

Цель настоящего исследования – оценка эффективности метода криоконсервации алканотрофных родококков при -85 ° С для длительного хранения генофонда коллекционных культур.

Методы исследования

Объектом исследования служили 15 штаммов родококков, принадлежащих к видам Rhodococcus erythropolis, R. rhodochrous, R. ruber, и поддерживаемых в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекций культур #768, . Культуры выращивали на мясопептонном агаре (МПА), а также минеральной среде в пропано-воздушной атмосфере (1:5), либо в присутствии н-гексадекана (1.0 об. %) (Каталог штаммов..., 1994) в качестве единственного источника углерода. В работе использовали бактериальные взвеси плотностью 107-108 кл/мл. В качестве криопротекторов применяли 10% глицерин или 5% диметилсульфоксид (ДМСО). В контрольных опытах клетки родококков суспендировали в дистиллированной воде без добавления криопротектора. Замораживание культур проводили при -85°С в морозильнике сверхнизких температур

MDF-U4086S (Sanyo, Япония) с резервной системой для поддержания температуры Back-up System CVK-UB2. Процесс восстановления замороженных клеток осуществляли путем оттаивания при комнатной температуре.

Число жизнеспособных клеток определяли микрометодом точечных высевов по колониеобразующей способности (Веслополова, 1995). В сравнительных экспериментах жизнеспособность культур параллельно оценивали путем специфического окрашивания бактерий 0.2% раствором йо-донитротетразолия фиолетового (Packard, 1971) и двухкомпонентным красителем Live/Dead Bac-Ligth Bacterial Viability Kit L1352, в соответствии с инструкцией производителя (Molecular Probes, Inc.; . В первом случае на планшетном фотометре (X 492 нм) Multiskan Ascent 354 (Thermo, Китай) регистрировали концентрацию активно респирирующих клеток по содержанию не растворимого в воде формазана, образующегося при восстановлении бесцветной соли тетразолия (Haines et al., 1995; Uraizee et al., 1998). Во втором – подсчитывали живые и мертвые клетки с помощью люминесцентного микроскопа (возбуждающий фильтр EX545) MС-400 F (Micros, Австрия). Цитоморфологические исследования проводили с помощью светлопольного микроскопа с фазовоконтрастным устройством Axiostar plus (Carl Zeiss, Германия) с использованием системы визуализации и анализа микроскопического изображения ВидеоТест-Размер 5.0 (ВидеоТест, Россия), включающей цветную цифровую систему ввода изображения Pixera PRO-150ES (Pixera, США). Эффективность криоконсервации оценивали по показателю выживаемости. Процент жизнеспособных клеток родококков рассчитывали относительно числа клеток, определяемого до криоконсервации. Проверку сохранения физиолого-биохимичских свойств бактериальных культур осуществляли путем контрольного определения ключевых признаков (Ившина и др., 1994). Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета компьютерных программ Microsoft Office Excel 2003, принимая уровень вероятности 95%.

Результаты и их обсуждение

В результате проведенных исследований установлено, что родококки, суспендированные в дистиллированной воде, довольно хорошо переносят процесс низкотемпературного замораживания с последующим оттаиванием при комнатной температуре. Так, выживаемость клеток представителей видов R. erythropolis, R. rhodochrous и R. ruber составляет от 55 до 70% (рис. 1) при средней исходной концентрации 4.3x107 кл/мл. Для повышения устойчивости клеток к воздействию низких температур целесообразно применение защитных веществ – криопротекторов (Пучков, Говорунов, 1983; Kisidayova, 2005). Их действие связывают со способностью вступать во взаимодействие с гидратной оболочкой биологически активных макромолекул и воздействовать, таким образом, на их структуру.

Выживаемость, % к контролю (до криоконсервации)

Рис. 1 . Влияние процесса криоконсервации на выживаемость коллекционных культур Rhodococcus spp .

Так механизм защитного действия глицерина, объясняется его адсорбцией на клеточной мембране и интерколяцией между молекулами липидов, способствующих лабильности мембран (Dyubko et al., 2006). При этом криозащитные вещества ослабляют эффект кристаллизации, изменяя ее характер (Волков, 1994).

По нашим данным, использование ДМСО в качестве криопротектора позволяет повысить показатель выживаемости замороженных клеток R. erythropolis в среднем до 80%, однако в течение 1-го года хранения численность жизнеспособных клеток в замороженной суспензии достоверно снижается до 45%. В то же время, при криоконсервации представителей данного вида с использованием глицерина высокий (80%) уровень выживаемости сохраняется в течение всего срока хранения (рис. 2). При этом показатель жизнеспособности отдельных штаммов R. erythropolis достигает 94%, что соответствует 8.3 x 10 7 кл/мл (табл. 1).

Срок хранения

Рис. 2. Динамика жизнеспособности коллекционных культур R. erythropolis при криоконсервации: 1 – контроль (без внесения протектора); 2 – в качестве протектора использовали глицерин; 3 – ДМСО

Изучение выживаемости коллекционных культур R. ruber после криоконсервации показало, что наибольшая (≥100%) степень жизнеспособности замороженных клеток регистрируется с использованием ДМСО сразу после низкотемпературного воздействия (рис. 3).

Таблица 1

Жизнеспособность коллекционных штаммов R. erythropolis после криоконсервации в течение 1 года

Штамм ИЭГМ	Криопротектор	Число жизнеспособных клеток/мл		Выживаемость, %
		до криоконсервации	через 1 год
200	Глицерин	(1.7 ± 0.38) × 107	(8,3 ± 0.75) ×107	94.32
	ДМСО	(1.8 ± 0.38) × 108	(6.0 ± 0.59) ×107	66.67
267	Глицерин	(9.6 ± 2.86) × 107	(4.5 ± 0.55) × 107	93.75
487	Глицерин	(1.4 ± 0.34) × 108	(4.7 ± 0.36) × 107	69.12
	ДМСО	(1.1 ± 0.28) × 108	(2.4 ± 0.35) × 107	44.44
507	Глицерин	(2.4 ± 0.43) × 108	(5.6 ± 0.33) × 107	46.67
	ДМСО	(7.6 ± 2.43) × 107	(1.4 ± 0.21) × 107	36.84
684	Глицерин	(9.6 ± 2.88) × 107	(4.5 ± 0.30) ×107	93.75
	ДМСО	(2,0 ± 0.37) × 108	(3.0 ± 0.51) × 107	30.00

Рис. 3. Динамика жизнеспособности R. ruber после криоконсервации:

1 – криопротектор ДМСО; 2 – глицерин ; 3 – без внесения протектора

По-видимому, это объясняется биологической особенностью представителей R. ruber , проявляющейся в начале стационарной фазы роста клеток, как то, присутствием палочковидных фрагментов, наряду с доминированием кокковидных форм, и последующей фрагментацией клеточного мицелия (Нестеренко и др., 1985). В течение одного года хранения уровень жизнеспособности R. ruber в этом варианте опыта достоверно снижается до 40–50%. Полученные данные свидетельствуют о преимуществе использования протектора ДМСО для краткосрочного (до 6 мес.) хранения родококков вида R. ruber .

Интересно отметить, что выживаемость представителей R. ruber в вариантах без применения криопротектора и с использованием 10% глицерина, на протяжении всего срока хранения оставалась на одном уровне. При этом средний процент выживаемости к концу 1 года хранения составлял 60– 70% от первоначального (рис. 3). Таким образом, применение ДМСО и глицерина в качестве протек- торов позволяет повысить степень выживаемости родококков в процессе низкотемпературного хранения.

Учитывая способность родококков утилизировать широкий спектр углеводородных соединений, нами проведен сравнительный анализ жизнеспособности культур, предварительно выращенных на углеводных и углеводородных средах. Установлено, что степень устойчивости к низкотемпературному воздействию культур, использующих пропан в качестве единственного источника углерода и энергии на 20% выше по сравнению с клетками родококков, выращенными на МПА (табл. 2).

Исследование выживаемости замороженных родококков, предварительно выращенных в присутствии н -гексадекана, показало, что содержание жизнеспособных клеток в суспензии после 1-го года криоконсервации снижается до 0.7–47.0%, составляя в среднем 16.2% (рис. 4). Однако на наш взгляд, это не связано с гибелью клеток, использующих н -гексадекан, в результате воздействия низкотемпературного фактора. Так, по данным микроскопического анализа (рис. 5), клетки родо-кокков, предварительно выращенные на среде в присутствиии н -гексадекана, собраны в плотные агрегаты размером от 8 до 12 мкм.

Это приводит к заниженным результатам численности бактериальных клеток в связи с формированием на агаризованной питательной среде колоний, выросших не из одной клетки, а из агрегатов, образованных множеством жизнеспособных клеток. Выявленный факт подтверждается результатами дифференцирующего окрашивания живых и мертвых клеток после криоконсервации с использованием флуоресцентных красителей. Так, процентное содержание бактерий, окрашенных в зеленый цвет компонентным красителем «Syto 9» и регистрируемых как живые, в 3.6 раза превышает таковое, полученное методом высева на агари-зованную питательную среду.

Таблица 2

Жизнеспособность родококков, предварительно выращенных на разных средах, после 1 года хранения при -85°С

Штамм R. ruber	Среда предварителного культивирования	Число жизнеспособных кл/мл		Выживаемость, %
		до криоконсервации	1 год после криоконсервации
ИЭГМ 71	МПА	(1.8 ± 0.27) × 108	(9.4 ± 0.52) × 107	52.22
	С3*	(1.4 ± 0.56) × 108	(1.4 ± 0.09) × 108	100.00
ИЭГМ 74	МПА	(2.0 ± 0.28) × 108	(1.2 ± 0.08) × 108	60.00
	С3	(4.4 ± 0.56) × 107	(3.5 ± 0.32) × 107	79.55
ИЭГМ 83	МПА	(1.2 ± 0.22) × 108	(8.2 ± 0.57) × 107	68.33
	С3	(3.3 ± 0.31) × 107	(1.9 ± 0.19) × 107	57.58
ИЭГМ 233	МПА	(2.4 ± 0.31) × 108	(9.6 ± 0.57) × 107	40.00
	С3	(2.7 ± 0.27) × 108	(1.7 ± 0.20) × 108	62.96
ИЭГМ 235	МПА	(2.6 ± 0.32) × 108	(1.3 ± 0.10) × 108	50.00
	С3	(5.9 ± 0.41) × 107	(4.0 ± 0.47) × 107	67.80
ИЭГМ 381	МПА	(1.3 ± 0.23) × 108	(7.8 ± 0.58) × 107	60.00
	С3	(5.6 ± 0.50) × 107	(4.0 ± 0.42) × 107	71.43
ИЭГМ 468	МПА	(2.0 ±0.28) × 108	(1.3 ± 0.04) × 108	65.00
	С3	(3.1 ± 0.37) × 107	(3.0 ± 0.26) × 107	96.77

* С3 – минеральная среда с пропаном.

ИЭГМ…ИЭГМ…

ИЭГМ…

ИЭГМ…

ИЭГМ…

■1 □ 2

ИЭГМ…

№1

ИЭГМ … ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^

Выживаемость, %

Рис. 4. Выживаемость родококков, предварительно выращенных на разных средах, после 1 года криоконсервации: 1 – жидкая минеральная среда с н -гексадеканом; 2 – мясопептонный агар

По нашим данным, эффективным способом учета жизнеспособности углеводородокисляющих родококков после криоконсервации является экспрессный спектрофотометрический метод, основанный на окрашивании активно респирирующих клеток 0.2% раствором йодонитротетразолия фиолетового. Установлена сильная (r>0.71) степень корреляции между показателем интенсивности окрашивания тетразолием и числом жизнеспособных клеток родококков, регистрируемых методом точечных высевов с достоверной вероятностью 95% (рис. 6).

Важным аспектом при оценке эффективности криоконсервации родококков является проверка сохранения их основных морфологических и фи- зиолого-биохимических особенностей. Цитологические исследования с определением размеров клеток не выявили достоверных различий морфометрических характеристик с исходными показателями после воздействия низкотемпературного фактора. То же следует отметить и в отношении основных макроморфологических признаков, в частности, размеров и формы колоний, их структуры, консистенции, оптических свойств и т.п. Кроме того, учитывая способность представителей Rhodococcus spp. к биотрансформации практически всех классов органических соединений, проведены контрольные тесты на способность родокок-ков к окислению ряда природных и антропогенных углеводородных субстратов. Анализ результатов свидетельствует о сохранении каталитической активности, присущей интактным клеткам родо-кокков, и после длительного хранения культур в замороженном состоянии. Так, в частности, про-панокисляющая способность и уровень биотрансформации клетками R. ruber β-ситостерола до стигмаст-4-ен-3-она, а также выявленная ранее способность некоторых штаммамов R. rhodochrous к окислению тиоанизола до фенилметилового сульфоксида не изменилась и после 2-х лет хранения.

Рис. 5. Клеточные агрегаты R. ruber ИЭГМ 231 после криоконсервации (фазово-контрастная микроскопия, увеличение ×1000)

Рис. 6. Оценка степени корреляции показателя жизнеспособности (%) криоконсервированных клеток родококков, оцениваемых методами точечных высевов (МТВ) и окраски тетразолием (МОТ)

Таким образом, метод криоконсервации актинобактерий рода Rhodococcus при -85°С, предполагающий использование бактериальных клеток с предварительно индуцированным алканотрофным метаболизмом и применение 10% глицерина в качестве криопротектора, обеспечивает высокую (106–108 клеток/мл) степень выживаемости родо-кокков и способствует сохранению их основных морфологических и физиолого-биохимических характеристик. По-видимому, устойчивость исследуемых культур к воздействию низкой температуры определяется характерными структурными и физиологическими особенностями данных актинобактерий (Ившина, 1997), как то: наличие сложного морфогенетического цикла развития, способ- ность к смене фаз существования, присутствие специфических липидных компонентов в составе клеточной стенки, накопление гранул поли-β-оксибутирата, синтез жирных кислот с нечетным числом углеродных атомов, поверхностно-активных соединений (биосурфактантов) и аминокислот при росте на углеводородсодержащих средах. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о перспективности метода низкотемпературного хранения практически ценных культур, поддерживаемых в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ, гарантирующего сохранение их жизнеспособности и функциональной активности.

Исследование выполнено при поддержке грантов ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» и Программы Президиума РАН «Биологическое разнообразие».