Особенности локализации обработки протеазы Arg-X в супраструктурах интерфазного хроматина в условиях остановки клеточного цикла бутиратом натрия при индукции роста морфогенеза зрелых эмбрионов зимней и яровой пшеницы

Как известно, фундаментальным свойством многих организмов является способность чувствовать, оценивать направление действия сигнала, реагируя на экологические условия окружающей среды. Классическим примером является яровизация пшеницы, где важнейшая роль принадлежит, как считают ученые (Angel, 2015) регуляции транскрипционной активности генов. Однако понимание того, как состояние хроматина изменятся в ответ на действие сигналов изменяющейся окружающей среды, способствуя адаптации развития растений и эпигенетическому сохранению в течение многих клеточных делений, остается во многом неясным (Berry, Dean, 2015). В зависимости от условий окружающей среды, хроматин способен к выбору части информации, которая затем реализуется в признаки, а так же приводит к изменению онтогенетической подпрограммы развития растений. Эти подпрограммы представляют собой строго упорядоченную во времени и пространстве скоординированную экспрессию сотен и тысяч генов (Lutova, 2010). Многократная пространственновременная реорганизация хроматина происходит при сохранении доступности определенных участков ДНК для регуляторных факторов и ферментов транскрипции в ходе выполнения морфогенетических подпрограмм развития (Razin, 2006). Хроматин может быть модифицирован множеством способов (Ivanova, Giljazetdinov, Ahmetov, 1975; Ivanova, 1977). В совокупности эти механизмы создают набор взаимосвязанных метаболических путей, которые все вместе вызывают изменения гетерополимерной матрицы хроматина. Одной из этих модификаций, которые остаются во многом недостаточно изученными, является регуляторный протеолиз (Ivanova, Davletova, 1986, Vossaert et al. 2014). Начиная с первых работ проведенных десятилетия назад, протеолиз был обнаружен в широком спектре эукариотических организмов (Dhaenens et al. 2014). В настоящее время протеолиз рассматривается как новый вид необратимых посттрансляционных модификаций (Ivanova, Vafina, 1998; Purohit et al., 2012; Panda et al. 2013; Azad, Tomar 2014). Это приводит к изменению парадигмы от концепции протеаз как белок-разрушающих ферментов, к протеазам как реконструкторам ключевых сигнальных молекул (Turk et al., 2012; Ivanova, Vafina, Ivanov, 2014).

Проведение исследований протеаз заметно увеличилось в последнее десятилетие, главным образом в результате очень быстрого развития новых технологий. Однако основные работы по исследованию протеолиза белков клеточного ядра в настоящее время активно проводятся только на модельных объектах животного происхождения. Работы по исследованию протеазо-процессинга на уровне супраструктурной организации интерфазного клеточного ядра и его транскрипционной активности у растений, в особенности в связи с процессами формирования озимых и яровых форм, в частности у пшеницы, в данный момент являются уникальными как в отечественной, так и в зарубежной науке (Ivanov et al. 2015; Ivanova et al. 2015 a, b, c). Новизна наших данных заключается в том, что мы на модельной системе ярового и выведенного из него озимого сорта, при инициации ростового морфогенеза зрелых зародышей пшеницы, рассмотрели проявление активности Арг-Х протеолитического процессинга на уровне отдельных супраструктур хроматина и входящих в их состав негистоновых и гистоновых белков. В ранее опубликованной работе (Ivanova et al., 2015 a) приведены данные по состоянию конформационных изменений молекулярногенетической основы морфогенеза супраструктур хроматина зрелых зародышей пшениц в период активного семенами водопоглощения.

Целью данной работы был анализ локализации активности Арг-Х протеазо-процессинга в условиях ингибирования деацетилирования негистоновых и гистоновых белков супраструктур клеточных ядер: нуклеоплазмы, хроматина, ядерного матрикса; в период остановки клеточного цикла в фазе G 0 / G 1 ; при биологическом покое, инициации активного водопоглощения; и влиянии этого процесса на организацию надмолекулярного ростового морфогенеза при индукции вегетативной фазы зрелых зародышей яровой и озимой пшениц.

MATERIALS AND METHODS

Подробное описание сортов Артемовки (яровой), выведенной из нее Мироновской 808 (озимой) и выведенной из последней Мироновской Яровой представлено в работе (Ivanov et al., 2015). Состояние воздушно-сухого семени и зародыша (находящиеся в состоянии биологического покоя), мы условно приняли за 0ч. Из воздушно-сухих семян (0ч), набухающих под водой («контроль») в течение 3ч, а далее высеянных для прорастания (6ч) («контроль») отделяли от эндосперма зародыши (рис.1-3: «контроль»), из которых выделяли клеточные ядра, их надмолекулярные супраструктуры: нуклеоплазму (Нп) – “лабильный хроматин” (Konarev, 2001), хроматин непрочно- (Хр-I) и прочно- (Хр-II) связанный с ядерным матриксом (ЯМ) и собственно ЯМ (рис. 1,2: супраструктуры), а также негистоновые (НГБ) и гистоновые (НI - линкерный, Н2А+Н2В, Н3+Н4: коровые) белки (рис. 1, 3: НГБ, гистоны) по способу подробно описанному в работах (Ivanova, 1972; Ivanova, Vafina, 1992; Ivanova, Vafina, 2011). Для замачивания семян и прорастания зародышей в условиях ингибирования деацетилирования белков (рис. 1-3: «опыт») был использован бутират натрия (Ivanova, Vafina, 2010). Активность Арг-Х протеолиза в супраструктурах клеточных ядер и выделенных из них НГБ и гистонов, оценивали по расщеплению Арг-Х связей в аргинин-обогащенном белке – протамине-Salmine-A-I («Merk»).

RESULTS

В данной работе наша задача заключалась в том, чтобы выявить в надмолекулярных структурах клеточного ядра зоны проявления активности Арг-Х протеазо-процессинга при условиях ингибирования деацетилирования белков – «опыт», в индуцированных к росту зрелых зародышей пшениц, сформировавшихся в разных условиях окружающей среды (рис. 1-3). Для более наглядного восприятия экспериментальных данных (рис. 1) представлено их схематическое изображение (рис. 2-3). В графическом представлении экспериментальных данных (рис. 1) показатели: 0-5 нмоль аргинина / (с ∙ мг белка) для супраструктур (рис.1: супраструктуры) и 0-2∙10-3 нмоль аргинина / (с ∙ мг белка) для негистонов (НГБ) и гистонов (рис.1: НГБ, гистоны) были условно приняты за «фоновую активность», которая отделена горизонтальной линией на каждом графике. Это было сделано с целью выделить наиболее яркие показатели «опытного» эксперимента. Поэтому в схемах (рис. 2, 3) представлены только «качественные» данные, которые были выше фона. Насчет «качественных» показателей уместно привести слова Резерфорда: «качественное соответствие теории и эксперимента – не что иное, как огрубленное количественное» (Tom, 2002, p.9).

АРТЕМОВКА (яровая) - исходный сорт пшеницы, для выведения Мироновской 808.

Активность Арг-Х протеазо-процессинга, в условиях «опыта», при воздействии бутирата натрия, сразу переключается на супраструктуры ядерного матрикса (рис. 1, 2: супраструктуры - «Артемовка-опыт»; ЯМ: 3ч, 6ч). Что касается следующего этапа эксперимента по определению локализации активности Арг-Х протеазо-процессинга в негистоновых и гистоновых блоках супраструктур клеточных ядер, проведенного в условиях влияния бутирата натрия на индукцию многоуровневого ростового морфогенеза зрелых зародышей пшеницы, то эти данные представлены на рисунке 1 и рисунке-схеме 3. В условиях ингибирования деацетилирования белков, блоки НГБ и гистонов не проявляют Арг-Х протеазо-процессинга (рис. 1, 3: «Артемовка: НГБ и гистоны» - «опыт»; 3ч, 6ч).

МИРОНОВСКАЯ 808 (озимая). В условиях процесса водопоглощения (3ч, 6ч) в присутствии бутирата натрия (рис. 1, 2: супраструктуры - «озимая-опыт»; Хр-I: 3ч, 6ч) Арг-Х протеазо-активность проявляется только в период метаболизма воды в семени (6ч) в супраструктурах Хр-I (рис. 1, 2: супраструктуры - «озимая-опыт»; Хр-I: 6ч). В условиях проращивания в среде бутирата натрия семян озимой пшеницы - Мироновской 808 (рис. 1, 3: «озимая-опыт»; 3ч), при активном водопоглощении семенами, в клеточных ядрах зародышей (3ч) происходит активация Арг-Х протеазо-процессинга на уровне коровых гистонов H3+H4 хроматина прочносвязанного с ЯМ и самого ЯМ (рис. 1, 3: «озимая-опыт»; Хр-I: НГБ; Xp-II: Н3+Н4; ЯМ: HI, Н3+Н4; 3ч). В период физиологических особенностей метаболизма воды в семени (6ч) (рис. 1, 3: «озимая-опыт»; 6ч) на уровне супраструктур Хр-I дополнительно включается Арг-Х протеазо-процессинг линкерного гистона HI, при одновременном протеазо-процессинге гистона HI и коровых белков Н2А+Н2В в супраструктурах Хр-II (рис. 1, 3: «озимая-опыт»; Хр-I: НГБ, HI; Хр-II: HI, Н2А+Н2В; 6ч). На уровне ЯМ (6ч) Арг-Х протеазо-процессинг активно проявляется в коровых белках Н2А+Н2В при следовых количествах Н3+Н4 (рис. 1, 3: «озимая-опыт»; ЯМ: HI, Н2А+Н2В, Н3+Н4; 6ч).

МИРОНОВСКАЯ ЯРОВАЯ выведенная из Мироновской 808 . На воздействие бутирата натрия, супраструктуры клеточных ядер не проявили Арг-Х протеазо-активности выше фоновой (рис. 1, 2: супраструктуры-«Мироновская Яровая- опыт»: 0ч, 3ч, 6ч). При проращивании семян Мироновской Яровой, в условиях бутирата натрия, в клеточных ядрах зрелых зародышей происходит сохранение Арг-Х протеазо-процессинга на уровне НГБ в Хр-II (рис. 1, 3: «Мироновская Яровая-опыт»; Хр-II: НГБ; 0ч, 3ч, 6ч) и пролонгирование активности на уровне НГБ

Figure 1. Активность Арг-Х протеолиза в нормальных условиях прорастания (Контроль) и в условиях влияния ингибирования деацетилирования белков (Опыт) в супраструктурах и выделенных из них блоков негистоновых и гистоновых белков зародышей пшениц сортов: Артёмовка (яровая) (1), выведенная из неё Мироновская 808 (озимая) (2) и выведенная из последней Мироновская яровая (3). Супраструктуры: Нп – нуклеоплазма (лабильный хроматин), Хр-I – хроматин непрочносвязанный с ЯМ, Хр-II - хроматин прочносвязанный с ЯМ, ЯМ – ядерный матрикс.

Figure 2. Схема распространения Арг-Х протеолитической системы на поверхности супраструктур интерфазных клеточных ядер зрелых зародышей пшениц.

Физиологические особенности семян
Биологический покой: воздушно-сухое состояние (0ч)		Процесс водопоглощения: набухание под водой в течение Зч		Метаболизм воды в семени и субклеточных структурах в течение последующих Зч; (6 ч)

Артемовна (яровая)

Мироновская 808 (озимая)

Мироновская Яровая

Ядра занимают около половины объема клеток. Хроматин в виде крупных компактных тяжей (хромонем).

Развитая сеть РН Fl-фибрилл в межхромосомных участках ядра

Характеристика клеточных ядер и хроматина зародышей семян

Объем ядер увеличивается: появляются многочисленные вакуоли, сообщающиеся с нуклеоплазмой. Хроматиновые структуры более рыхлые. Увеличивается сеть межхромонемных РНП-фибрилл

Вакуоли уменьшаются. Рыхлые глыбки хроматина равномерно распределены по всему ядру. Начало деконденсации хроматина. Завершающий этап первой транскрипционной активации хроматина через 6 ч

Обозначение супраструктур клеточного ядра:

о

Нп - Нуклеоплазма - диспергированные (10 нм нуклеосомные) нити ДНК (лабильный хроматин);

Хр I - "30 нм (?)" хроматиновые (эу-) фибриллы: непрочносвязанные с ЯМ; богатые транскрипционно активными зонами;

Хр II - прочносвязанный с ЯМ с четкой компартментализацией гетерохроматин;

ЯМ - ядерный матрикс - "полиэдр" упакованного генома для функциональной компартментализации клеточного ядра.

Черный цвет указывает на супраструктуры проявления Арг-Х протеазо-процессинга. Контроль - прорастание в нормальных условиях,

Опыт - прорастание в условиях ингибирования деацетилирования белков.

Figure 3. Схема распространения Арг-Х протеолитической системы в негистоновых и гистоновых блоках супраструктур интерфазных клеточных ядер зрелых зародышей пшениц. НГБ – негистоновые белки; HI – линкерный гистон; коровые гистоны: H2A+H2B – умеренно лизин богатые, H3+H4 – аргинин богатые.

лабильного хроматина (3ч) и ЯМ (6ч) (рис. 1, 3: «Мироновская Яровая - опыт»; Нп: НГБ, 3ч; ЯМ: НГБ, 6ч), кроме того, период водопоглощения (3ч) сопровождается включением в протеазо-процессинг коровых гистонов Н2А+Н2В лабильного хроматина (Нп), ЯМ и коровых гистонов Н3+Н4 в Хр-II (рис. 1, 3: «Мироновская Яровая - опыт»; Нп: НГБ, Н2А+Н2В; Хр-II: НГБ, Н3+Н4; ЯМ: Н2А+Н2В; 3ч). В период метаболизма воды в семени (6ч) переключение протеазо-процессинга в негистоновых и гистоновых компонентах супраструктур происходит следующим образом: (рис. 1, 3: «Мироновская Яровая-опыт»; Хр-I: НI, Н3+Н4; Хр-II: НГБ; ЯМ: НГБ, НI, Н3+Н4; (6ч).

DISCUSSION

В предыдущих работах (Ivanova et al., 2015 a, b, c) дана подробная характеристика физиологических и молекулярно-генетических особенностей зрелых зародышей пшениц, сформировавшихся в условиях экологического стресса, а также представлен анализ экранируемости морфогенетических интерфазных супраструктур хроматиновой матрицы в процессе метаболизма инициации водопоглощения. Анализ проделанной работы позволил предположить, что в условиях многолетней адаптации к холодовому шоку у пшеницы на уровне супраструктур хроматина, главным образом ЯМ (упакованный в ядерный матрикс геном (Razin et al., 2014), происходит тотальная экранируемость поверхностных аргинин-Х сайтов к регуляторному протеазо-процессингу (Ivanova et al., 2015 a).

Весь представленный блок информации о фазах физиологии водопоглощения семенами, о состоянии гетерополимерных супраструктур хроматиновой матрицы, о лабораторно-долголетнем отборе и динамики выращивания и «перевода» яровой пшеницы в озимую, последнюю вновь в яровую; о состоянии поверхностных супраструктур хроматиновой матрицы и их белков к Арг-Х протеазо-процессингу, как механизму быстрого реагирования на окружающие условия среды приводит пока к «огрубленному» предположению, что основная роль, во всей выше изложенной динамики молекулярно-генетического морфогенеза, периода остановки клеточного цикла в фазе G0 / G1, принадлежит НГБ и НI. Именно в НГБ находятся блоки регуляторных белков и шапероны, участвующие в нуклеосомной организации хроматина (Ellis, 1990) и способствующие взаимодействию с коровыми гистонами (Bondarenko et al., 2015). Что касается НI (линкерный гистон, не входящий в состав нуклеосомного ядра), то это один из основных структурных белков хроматина, известен давно. Считают, что НI участвует в организации хроматиновых структур высшего порядка, в частности 30-нм фибриллы. Наиболее вероятным местом локализации этого белка является область в районе оси симметрии нуклеосомы, которая расположена рядом с участками входа и выхода ДНК с нуклеосомной частицы. Ключевая роль при связывании НI с нуклеосомой принадлежит не точной последовательности аминокислот в его фрагментах, а скорее всего характеру боковых цепей, их размеру, заряду и гидрофобности (Ljubitelev et al., 2016). Доказано, что при потере одного из вариантов линкерного гистона остальные способны его замещать без заметных физиологических изменений (Ljubitelev et al., 2016). Кроме того, глобулярный домен линкерных гистонов имеет структуру типа «спираль с крылом», включающую в себя мотив «спираль— поворот—спираль». Укладка «спираль с крылом» распространена среди белков, взаимодействующих с ДНК. Почти вся поверхность глобул линкерных гистонов заряжена положительно в отличие от большинства других белков с укладкой «спираль с крылом», обладающих дипольным моментом. При этом негистоновые белки с такой укладкой имеют только один сайт связывания с ДНК, тогда как на глобулах линкерных гистонов таких сайтов не менее двух, хотя их точное положение до настоящего момента не определено. Все предложенные модели положения линкерного гистона на нуклеосоме также предполагают наличие, по меньшей мере, двух контактов с ДНК (Ljubitelev et al., 2016). Ранние данные по соотношению содержания K/R в НГБ и НI соответственно составляло 2,2; 11,2 (Ivanova, 1977; Ivanova, Ahmetov, 1987). То есть, НГБ имеют значительно больше возможностей для Арг-Х протеазо-процессинга, чем линкерный гистон. Но преимущество последнего заключается в том, что он обладает дипольным моментом. Основательный анализ структуры и функции линкерных гистонов, приведенный в обзорной статье (Ljubitelev et al., 2016) и сопоставление литературных данных с экспериментальными результатами нашей работы по молекулярно-генетическим основам инициации морфогенеза зрелых зародышей пшениц, сформировавшихся в разных условиях экологической среды; позволили предположить, что траектория эпигенетической памяти вполне может быть, прежде всего, взаимосвязана с функционированием Арг-Х протеазо-процессинга на уровне НГБ и НI. Весь объем вышеприведенной экспериментальной работы был проведен в условиях остановки клеточного цикла в фазе G0 /G1 бутиратом натрия, который является побочным продуктом углеводного обмена (Dong et al., 2015; Li et al., 2015) и ингибитором деацетилирования белков. Что касается ацетилирования гистонов, то оно наиболее широко исследовано и охарактеризовано как посттрансляционная модификация (Ivanova et al., 1975, Ivanova, Ahmetov, 1987; Wolffe, Hayes, 1999; Telles, Seto, 2012). Молекулярный механизм такой модификации заключается в добавлении ацетильной группы к аминогруппе терминальных остатков лизина в хвостовой области коровых гистонов, главным образом H3 и H4, с помощью класса белков названных ацетилтрансферазами гистонов (HATs). Отрицательно заряженные ацетильные фрагменты, добавленные к гистонам, отталкивают отрицательно заряженную фосфатную основу ДНК. Это отталкивание делает ДНК доступной для различных факторов инициации транскрипции (Majdzadeh et al., 2009). Релаксированная и открытая таким способом хроматиновая матрица становится легко доступной для механизма транскрипции, что облегчает связывание и прохождение РНК полимеразы (Schones et al., 2008; Wang et al., 2009, 2014). Таким образом, ацетилированные гистоны выступают в качестве платформы для связывания белков бромо-доменов, которые являются активаторами транскрипции и осуществляют поддержание состояния эухроматина (Shogren-Knaak et al., 2006; Parbin et al., 2013). Кроме того, ингибиторы гистондеацетилаз нацелены и на негистоновые белки, которые могут прямо или косвенно влиять на судьбу клеток, и весьма вероятно, что эти действия пересекаются с каноническими воздействиями ингибиторов гистондеацетилаз на экспрессию генов (Grant, Dai, 2012; Rosato, Grant, 2005; Bose et al., 2014).

Таким образом, в интерфазных клеточных ядрах: яровой и выведенной из неё озимой пшеницы, как в контрольном варианте эксперимента, так и в условиях ингибирования деацетилирования белков; наблюдается реорганизация экранируемости белковых блоков не только на поверхности супраструктур, но и в их внутренней негистоновой и гистоновой реорганизации в течение физиологических особенностей системы водопоглощения семенем. Что вполне может быть связано с активацией элементов LCR (locus control regions), имеющих отношение к гистоновому коду. В гипотезе гистонового кода протеолиз рассматривается как новый вид необратимых пост трансляционных модификаций гистонов. Однако экспериментального подтверждения эта гипотеза ещё не получила (Purohit et al. 2012). Тем не менее, поиск такой протеазы продолжается. Роль аргинина в организации динамики хроматиновой матрицы давно находится в центре внимания ученых (Smith et al., 1970). Длинные боковые гуанидиновые группы аргинина на поверхности надмолекулярных белковых комплексов выполняют роль восприятия как внутренних, так и внешних сигнальных систем, поступающих из окружающей среды. До сих пор не выясненной, интересной особенность аргинин-богатого гистона Н4, как у растений, так и у животных, является наличие определенных повторяющихся последовательностей, которые предстоит ещё расшифровать (Smith et al., 1970).

Представляя морфогенез как многоуровневый процесс, из всех межуровневых отношений при индукции прорастания яровых и озимых семян, их пространственно-временных периодов, мы для эксперимента выделили уровень организации интерфазной хроматиновой матрицы клеточного ядра и входящих в её архитектурный состав следующих гетерополимерных-надмолекулярных комплексов: нуклеоплазменного (лабильного), непрочно- и прочносвязанного с ядерным матриксом хроматина и собственно ЯМ. Расположение хромосомных территорий имеет важное значение для процессов репликации, транскрипции, репарации и рекомбинации. По всей вероятности филогенетическая принадлежность вида, клеточный цикл, состояние дифференциации влияют на архитектуру интерфазного ядра. Считают, что имеются морфологические ограничения и эпигенетические воздействия на ядерную архитектуру, эволюционную стабильность механизмов хромосомных территорий и изменения ядерной архитектуры (Schubert, Shaw, 2011). Мы предположили, что молекулярный морфогенез на уровне надмолекулярных структур клеточного ядра может быть связан с ослаблением межнадмолекулярных белковых связей, выраженных чувствительностью к Арг-Х протеолитическому процессингу. Для того чтобы судить о надмолекулярном морфопроцессе, мы выбрали определенный временной интервал эксперимента.

Возможно, наши экспериментальные данные будут полезны для тех, кто занимается разработкой логикоматематических схем теории биологической специфичности, о которых писали Ж-М Лен (1998), Р.Том (2002), в области сложной проблемы динамики молекулярного и супрамолекулярного морфогенеза.