Особенности мацерации коры древесных растений

Представления о строении, росте и развитии клеток и тканей растений позволяют понять функциональную значимость тех или иных структур и отдельных элементов растительного организма. Изменение количественных параметров во внутренней структуре растений, произрастающих в стрессовых условиях, является их адаптивной реакцией на воздействие факторов окружающей среды [7–9 и др.]. Важнейшее направление исследований нашей лаборатории ‒ изучение влияния неблагоприятных экологических факторов, обусловленных активным магматическим и грязевым вулканизмом, условиями морских побережий, высотой над уровнем моря, на внутреннюю структуру коры древесных растений [3, 20, 34].

Кора древесных растений – сложный и многофункциональный комплекс тканей. Снаружи однолетний стебель покрыт фотосинтезирующей эпидермой, которая сменяется вторичной покровной тканью – перидермой, в свою очередь состоящей из феллемы (пробки), феллогена (пробкового камбия) и феллодермы (паренхимы). Повторные перидермы чаще образуются в более глубоких слоях коры, отсекая вышележащие ткани, формируя у некоторых видов ритидом (корку) – комплекс мертвых тканей, включающих не только саму перидерму, но и ткани, расположенные выше заложения повторных перидерм. Следом за эпидермой или первой перидермой располагается колленхима или гиподерма (у голосеменных), паренхима первичной коры, первичные механические элементы и проводящая ткань – флоэма, затем камбий, который кнаружи откладывает флоэму, вовнутрь – ксилему (древесину). Флоэма и ксилема (первичная и вторичная) – проводящие ткани, осуществляющие соответственно нисходящий и восходящий ток веществ в стебле. Вторичная флоэма делится на проводящую и непроводящую. Проведение веществ осуществляется по проводящей флоэме, которая функционирует у большинства видов 1 год. Непроводящая флоэма не осуществляет проведение веществ, но в ее состав входят живые паренхимные клетки: аксиальная и горизонтальная паренхима. Эта наиболее общая топография тканей не отражает гетерогенность каждой из тканей и особенности их строения у разных видов [9, 21].

Для изучения клеточного и тканевого уровней применяются различные типы микроскопии (сканирующая, электронная, конфокальная, лазерная, рентгеновская и др.), наиболее широко и давно используемая – световая микроскопия. Для подготовки материала к исследованиям методами микроскопии разработано большое количество методик резки, окраски, контрастирования и др. В ходе исследований появляется множество модификаций и отступлений в методических подходах. Например, для уточнения строения проводящих элементов проводится мацерация растительного материала, которая применяется преимущественно для анализа строения клеточных оболочек, и, в подавляющем большинстве случаев, для древеси- ны и склеренхимы коры. В ботанической микротехнике существует немалое количество методов и методических подходов по отношению к мацерации [10, 11, 16, 19, 25, 26, 32, 33]. Поскольку кора древесных растений – это комплекс тканей, которые состоят из клеток, отличающихся функциональной активностью, толщиной клеточных стенок, плотностью сложения их в самой ткани и др., это требует наблюдения за процессом мацерации и анализа всех элементов коры. Мы остановились на методике, которая отвечает нашим требованиям и является наименее трудоемкой [30]. С одной стороны, она позволяет экономить время, с другой – выделять и тонкостенные (ситовидные трубки, клетки-спутницы, паренхимные клетки), и толстостенные элементы (волокна, склереиды, феллему), для которых необходимо применять разные методики с кипячением и (или) применением агрессивных химических веществ (едкой щелочи, концентрированных кислот), использующиеся в перечисленных выше методиках. Кроме того, ледяная уксусная кислота и перекись водорода являются для нас наиболее доступными реактивами.

Исследования нашей лаборатории основываются на изучении внутренней структуры стеблей древесных растений. Весь процесс изучения внутренней структуры коры методом световой микроскопии занимает значительное количество времени и является довольно трудоемким. Он состоит из нескольких этапов: отбор и фиксация образцов в поле; хранение фиксированных образцов как в условиях поля, так и в лаборатории; подготовка лабораторной посуды; приготовление реактивов и красителей; подготовка образцов для резки с помощью микротома или для мацерации; окрашивание, микрохимические реакции для качественного определения веществ и их групп; выполнение и заключение микросрезов в монтирующую среду, исследование срезов под микроскопом, их статистическая обработка и интерпретация результатов. В нашей лаборатории разработаны специфические модификации методических подходов на всех этапах ‒ от сбора образцов в поле (рис. 1) до интерпретации результатов [4–6, 37, 38].

Особые трудности возникают при мацерации коры и слагающих ее тканей, в особенности флоэмы, поскольку она является менее одревесневшей и стабильной тканью, чем ксилема, которая остается сравнительно неизменной в своем строении в течение онтогенеза. Это требует особого подхода не только к разным видам растений, но и к каждому частному случаю. Чаще всего

Рис. 1. Сбор материала.

Полуостров Камчатка. Гидротермальные источники «Дачные (влк. Менделеев)»

Fig. 1. Collection of material. Kamchatka Peninsula. Hydrothermal vents Dachnye (Volcano Mutnovsky)

это касается варьирования времени экспозиции, центрифугирования и разбивания на магнитной мешалке; возможно применять вариации с изменением температуры в термостате, концентрации раствора, чтобы достичь хорошего отделения требуемых для анализа элементов. В свою очередь индивидуального подхода в подготовке мацерируемого материала требуют стебли разного возраста, поэтому в ходе подготовки мы модифицируем методические алгоритмы, отмечаем их в рабочем дневнике и добавляем в методику: изменения времени экспозиции определённого вида, места сбора, возраста стебля, степени очистки и подготовки материала к мацерации. В наших исследованиях мы используем методику, разработанную Ge Wang с соавторами (2011) и применявшуюся для анализа древесных волокон кенафа, трахеид китайской ели и склереид бамбука. В указанной работе описаны состав раствора для мацерации, его концентрация и экспозиция в термостате. Мы адаптировали эту методику для коры древесных растений и достаточно подробно описываем, как избежать тех или иных трудностей на стадии пробоподго-товки и после выемки из термостата до формирования временных препаратов.

Целью данной работы является изучение способов пробоподготовки к мацерации коры древесных растений и приемов подготовки мацерированного материала для микроскопии. Для этого мы используем разделение тканей коры в многолетних стеблях до мацерации, а также разделение мацерированного материала при помощи центрифугирования и разбивания на магнитной мешалке.

Материалы и методы

При отборе образцов древесных растений для структурного анализа мы используем принятые в геоботанических исследованиях методические подходы [1, 14, 17]. В зависимости от типа и характера растительности выбираем размер пробной площади. Кроме этого, закладываем трансекты по градиенту высоты над уровнем моря или воздействия источника природного стресса в каждом местообитании. Внутри каждой пробной площади мы закладываем 3 площадки для отбора образцов древесных растений. Важно правильно выбрать оптимальные для исследования внутренней структуры стебли. Мы используем классификации по Серебрякову И.Г. (1949) и Мазуренко М.Т, Хохрякову А.П. (1977) для выбора и определения типов побегов. Мы отбираем для структурного анализа удлиненные побеги ветвления. Деревья выбираем с кроной, которая формируется на одинаковом уровне (в диапазоне около 1/3, 1/2 или 2/3) по высоте ствола. Для оценки возраст-за-висимых признаков и состояний растений необходимо собрать образцы максимально полно, то есть выбрать такой возрастной шаг отбора, при котором структурные признаки коры и древесины будут изменяться последовательно от последнего годичного побега до основания ствола или стволика. Обязательно следует обращать внимание на заглубление – геофитизацию стволиков и стволов в субстрат. По нашим наблюдениям, это очень распространенное явление у древесных растений в условиях вулканических ландшафтов [3, 15]. Мелкие кустарнички иногда фиксируются целой куртиной или ее фрагментом. В лаборатории для учета большого количества накопившегося материала мы вносим информацию об образцах в базу, в ней указывается вид, дата отбора, географические координаты, географическое название места сбора, характеристика объекта и краткие особенности фитоценоза, коллекторов, жизненная форма, количество листов гербария, кернов, «скруток» (фрагменты стеблей возраста определенного диапазона или особь целиком, упакованные в этикетку), фрагментов стеблей и стволов для коллекции и место хранения (маркировка контейнера), в котором находятся объекты для изучения.

Контейнеры хранятся в металлических шкафах (рис. 2). При необходимости исследования того или иного вида древесного растения контейнер с ним вынимаем из шкафа, вскрываем при соблюдении техники безопасности (халат, респиратор, перчатки, очки). При помощи пинцета во включенном вытяжном шкафу «скрутки» с об- разцами вынимаем из фиксатора (спирт+глицерин в соотношении 1:1 или 9:1 для молодых побегов) в лоток. Для текущей работы выбираем необходимые образцы для анализа и складываем в пластиковые банки для пищевых продуктов с прорезиненным кольцом для уплотнения. Образцы мы храним в фиксаторе в 5–10-литровых контейнерах для жидких пищевых продуктов и засолки рыбы. Предварительно запланированные для исследования образцы вынимаем из зафиксированного материала. «Скрутку» развязываем и на разделочной доске из образцов вырезаем отрезки стебля необходимого возраста (рис. 3). Для определения и уточнения возраста стебля перед вымачиванием проводим изготовление временных препаратов с поперечными срезами. Срезы готовим бритвенным лезвием от руки, помещаем в каплю воды на предметное стекло. Возраст стебля определяем по числу годичных приростов древесины под световым микроскопом (рис. 4). После обнаружения стебля необходимого возраста вымачиваем материал в дистиллированной воде для удаления спирта и глицерина. Для ускорения процесса вымачивания отсекаем небольшие фрагменты необходимых для анализа участков. В этом случае время проводки образцов дистиллятом сокращается

Рис. 2. Хранение образцов в контейнерах в спирто-глицериновой смеси в условиях лаборатории

Рис. 3. А – контейнер с образцами и лоток для выемки; Б – поиск и развязывание «скрутки»; В – образцы для определения возраста

Fig. 2. Storage of samples in laboratory – in containers, in alcohol-glycerol mixture

Fig. 3. A – Sample container and tray; Б – search and rolled samples unleashing; B – Samples for determining age

до 10‒24 часов (рис. 5). Определение возраста стволовой части выполняем либо на керне (цилиндрические кусочки древесины, полученные с помощью возрастного бура), взятом при помощи возрастного бура (бурава) Haglof (инструмент, который позволяет извлекать керн (образец) из ствола дерева с целью исследования возраста, динами-

Рис. 4. Определение возраста образцов перед мацерацией

• Fig. 4.    Determining the samples age before maceration

ки роста и состояния), либо непосредственно на спиле перед фиксацией; информацию о возрасте вносим в этикетку, в которую упаковываем фрагмент ствола.

Для мацерации можно применять и свежий материал, взятый в природе. При этом время от сбора образца до его подготовки к мацерации не должно превышать суток при хранении в холодильнике. При мацерации стволовой части коры выбираем необходимый участок: отсекаем древесину и ближайший к камбию участок с проводящей флоэмой, который будет использоваться для мацерации (рис 7А), а в оставшемся фрагменте с непроводящей флоэмой отсекаем периферическую часть коры с перидермой или коркой и старовозрастной непроводящей флоэмой. Таким образом, для мацерации остаются фрагмент с проводящей флоэмой и камбием и фрагмент со слоем непроводящей флоэмы, который был расположен ближе к проводящей флоэме (в этой части обнаруживаются еще не смятые ситовидные трубки), мацерируем их в разных бюксах (рис. 5). При

Рис. 5. А – вымачивание образцов определённого возраста; Б – вымачивание отсечённых фрагментов стебля

• Fig. 5.    A – Soaking of samples of a certain age; Б – Soaking of cut-off fragments of stem

Рис. 6. Приготовление мацерирующей смеси

• Fig. 6.    Preparation of the macerating composition

необходимости отдельно мацерируем и другие вышележащие участки коры. Если необходимо мацерировать однолетний стебель или стебель небольшого диаметра (менее 5 мм), отсекаем фрагменты стебля вместе с древесиной и перидермой.

Небольшие фрагменты коры размером 1,0–2,0 мм × 1,0–3,0 см помещаем в бюксы емкостью 30 мл и заливаем раствором для мацерации, приготовленным непосредственно перед использованием (рис 6, 7Б). Состав мацерирующей жидкости: 4 части дистиллированной воды: 5 частей концентрированной (ледяной) уксусной кислоты: 1 часть перекиси водорода (4Н₂О: 5СН₃СООН: 1 34–36,5% Н₂О₂). Плотно закрываем притёртой крышкой бюксы с образцами в растворе для мацерации и помещаем в термостат с температурой 50 °С [30] (рис. 8). Время экспозиции в термостате может быть различным: от нескольких часов до нескольких суток. Например, для стволовой части Betula ermanii Cham. время экспозиции в термостате в мацерирующей жидкости составляет 2–3 суток, это время увеличивается при мацерации стволовой части образцов с большим объе-

Рис. 7. А – отсекание фрагмента, необходимого для мацерации; Б – помещение образцов в мацерирующую смесь

• Fig. 7.    A – Cutting off the fragment required for maceration; Б – Placement of samples in the macerating composition

мом лигнифицированных и склерифицированных элементов. Увеличение мощности последних наблюдается нами в коре растений, произрастающих в экстремальных условиях [3, 14, 37]. Для однолетних стеблей этого вида, взятых в нормальных условиях, время экспозиции составляет 1‒2 суток, а произрастающих в условиях агрессивных сред ‒ до 2,5 суток, например, с фумарольных и сольфатарных вулканических полей. Для однолетних стеблей Betula platyphylla Sukaczev время экспозиции составляет 12‒24 часа, в зависимости от условий местообитания и времени сбора, а также части стебля (ближе к апикальной части или к основанию годового прироста). Для сокращения времени экспозиции материала многолетних стеблей после его проводки водой отделяем по возможности перидерму и древесину и мацерируем только ту часть, которая необходима для микроскопического анализа внутренней структуры коры: проводящая флоэма для выявления

Рис. 8. Мацерация в термостате

• Fig. 8.    Maceration in the thermostat

особенностей проводящих живых элементов, непроводящая флоэма для исследования склерифи-цированнных элементов, элементы кортекса – для изучения паренхимы, первичных механических элементов и др. При исследовании толстостенных элементов не всегда удаётся полностью очистить материал от неиспользуемых для анализа тонкостенных элементов при подготовке материала к мацерации, удаляем их после экспозиции в мацерирующем растворе. Остатки древесины, перидермы, склеренхимы распадаются значительно позднее живых элементов коры. Пользуясь этим, мы убираем паренхимные клетки и облитерированные ситовидные трубки и мацерируем далее склеренхиму, волокна или феллему в зависимости от того, из какой части коры требуются толстостенные элементы для анализа.

После помещения в бюксы мацерируемый материал периодически проверяем на готовность. Последнее определяется обесцвечиванием (белые или бледно-жёлтые) фрагментов растения, поме- щенного в мацерирущий раствор и появлением небольшого количества взвеси над твёрдым осадком. Материал готов, если он легко раздавливается препаровальной иглой на предметном стекле и под покровным стеклом в капле воды определяются отдельные элементы ткани. После извлечения мацерированного материала из термостата хорошо промываем его дистиллированной водой до удаления запаха уксусной кислоты. Чтобы не потерять отдельные элементы коры при сливе, верхнюю прозрачную фракцию каждый раз отстаиваем до образования осадка и только после этого сливаем (рис. 9). Отбор желательно производить пипеткой. Для лучшего распределения на отдельные элементы мацерированный материал, предварительно помещенный в бюксы в небольшом количестве дистиллированной воды (10–20 мл), разбиваем в стеклянной бюксе на обычной магнитной мешалке (Эксперт-Эконикс, Ритм-1, УММ с кондуктометром Эксперт-002 (Эконикс) или Intillab TM Magnetic Stirrer) со специальным магнитным якорем. Процесс разбивания занимает 5‒20 мин до получения мутной взвеси (рис. 10). Зачастую из-за разного времени распадения твёрдых и мягких элементов необходима их сепарация. В случае наличия большого количества нераспавшихся склеренхимных элементов, остатков неудалённой древесины и феллемы при подготовке материала к мацерации в виде твёрдого осадка мацерированный материал выливаем в чашку Петри и не-распавшиеся твёрдые фрагменты тканей удаляем пинцетом под лупой (рис. 11). В нашей лаборатории мы используем для этого стационарную лупу с подсветкой (Лупа-лампа с подсветкой Kromatech бестеневая 2/20х, 85 мм, с прищепкой). Готовую взвесь с паренхимными клетками и ситовидными элементами переливаем в конусные пробирки и центрифугируем 2‒5 минут при 1,0‒1,5 тыс. оборотов в минуту на центрифуге Liston C 2203

Рис. 9. Промывание материала от мацерирующей смеси

• Fig. 9.    Washing the material from the macerating composition

  

  Рис. 10. Разбивание материала на магнитной мешалке

  
  
  

  Рис. 11. Удаление твёрдых участков коры в мацерированном материале

  
  

Fig. 11. Removal of hard fragments of bark from the macerated material

Fig. 10. Breaking up the material on a magnetic stirrer

(рис. 12). Затем со дна пипеткой собираем осадок и переносим на предметное стекло. Готовим временный препарат с дистиллированной водой или с добавлением глицерина для уменьшения скорости испарения пленки воды под покровным стеклом. Пробирки с материалом закрываем пробкой и хра- ним в холодильнике. При необходимости контрастирования (рис. 13) под покровное стекло капаем немного сафранина для окрашивания лигнифи-цированных элементов или нильского синего для окрашивания ситовидных полей и ситечек. После готовности анализируем и фотографируем препарат под микроскопом AxioScop А1 (Zeiss) при помощи программного обеспечения ZEN 2 (рис. 14). Возможно приготовить постоянные препараты из мацерированного материала стандартным спосо-

Рис. 12. А – центрифужные пробирки со взвесью мацерированного материала;

Б – взвешивание пробирок для уравновешивания в центрифуге; В – центрифугирование;

Г – прозрачная верхняя фракция и осадок со взвесью и твёрдыми частицами;

Д, Е – слив верхней прозрачной фракции; Ж – готовый материал для анализа

Fig. 12. A – centrifuge tubes with a suspension of macerated material; Б – test tubes weighing for balancing in a centrifuge; B – centrifugation; Г – transparent upper fraction and sediment with suspension and solid particles; Д, E – draining the upper transparent fraction; Ж – ready material for analysis

Рис. 13. Готовый для анализа контрастированный препарат с мацерированным материалом

Fig. 13. Contrast preparation of macerated material ready for analysis бом, применяемым в нашей лаборатории, ‒ это регрессивный метод окраски сафранином и нильским синим с вымыванием красителей при помо-

Рис. 14. Анализ мацерирированного материала под микроскопом (на мониторе компьютера членик ситовидной трубки Betula platyphylla)

Fig. 14. Analysis of the macerated material under the microscope (sieve-tube element of Betula platyphylla on the computer monitor)

щи постепенного повышения концентрации раствора этилового спирта [17, 19].

Заключение

Таким образом осуществляется индивидуальный подход при подготовке материала к микроскопированию, в том числе мацерации, в каждом отдельном случае. Нами используется сепарация, то есть выделение для анализа необходимых участков и типов тканей (мягких и твердых) на каждом этапе мацерации; варьирование времени экспозиции для определённого вида, места сбора и фрагмента ткани; разбивание мацерированного материала на магнитной мешалке до взвеси, в которой клетки отделены друг от друга; центрифугирование для разделения твердой, мягкой и жидкой фракций.

Работа выполнена в рамках государственного задания ИМГиГ ДВО РАН.