ОСОБЕННОСТИ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИИ БЕТА-АМИЛОИДНЫХ ПЕПТИДОВ (ПЕПТИДОВ АЛЬЦГЕЙМЕРА)

Количественное определение бета-амилоидов (Aβ) в биологических пробах имеет важное значение для диагностики болезни Альцгеймера. Одним из важных методов анализа Aβ является масс-спектрометрия с изотопно-меченным стандартом Aβ (15N или 18O). Эта статья является предупреждением о возникновении систематических ошибок такого определения в свете открывшихся обстоятельств. А именно, возможности существования Aβ в виде двух форм — нативной и денатурированной. Последняя образуется при нагревании Aβ в кислой среде или растворении его в DMSO. Причем денатурированная форма дает в масс- спектрах сигнал в несколько раз (примерно в 3 раза) более интенсивный, чем нативная.

Однако столь значительное изменение интенсивности сигналов в масс-спектре явилось для нас неожиданностью, побудившей предпринять исследование этого феномена. Эта задача представлялась нам тем более важной, что при анализе бе-та-амилоидов в крови человека в целях диагностики болезни Альцгеймера такая ошибка могла бы привести к ошибочному отнесению патологии к норме.

Принципиальные ошибки измерения концентрации Aβ методом количественной масс-спектрометрии возникают тогда, когда определяемый Aβ относится к нативной форме, а его изотопно-меченный стандарт — к денатурированной. Такая ситуация типична, когда анализируемый Aβ имеет природное происхождение, а стандарт используется в виде раствора в DMSO (этот растворитель часто применяется для приготовления растворов Aβ, поскольку он не летуч и хорошо растворяет Aβ в отличие от других растворителей). При этом DMSO действует как денатурирующий агент. Ранее в работе [1] 2015 г. уже отмечалось, что при использовании DMSO в качестве растворителя могут происходить изменения физико-химических свойств пептидов, однако конкретно бета-амилоиды в ней не были упомянуты.

В предыдущей нашей работе [2] было обнаружено, что нативные Aβ образуют комплекс с α2M, вследствие чего тот перестает взаимодействовать с трипсином. Т.е. Aβ способны выступать в роли ингибитора этого взаимодействия, тогда как денатурированные Aβ теряют такую способность. Это обстоятельство позволяет называть нативную форму Aβ активной, а денатурированную — неактивной. Кинетика дезактивации Aβ была нами ранее [2] изучена на основании измерения количества фрагмента Pep-α2M, отщепляемого трипсином от человеческого α2M (у мышиного α2M такого отщепления не наблюдается). Метод работы с α2M и трипсином [2] позволил точно определять соотношение активной и неактивной форм Aβ в их смеси, а следовательно, и следить за процессом дезактивации Aβ в различных условиях. Недостатками указанного метода являются его трудоемкость и нетехнологичность.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

Пептид VGFYESDVMGR, синтезированный в ООО "НПФ Верта". Трипсин свиной "Promega". DMSO "Sigma-Aldrich". H 2 ¹⁸O (97% ¹⁸O) "Sigma-Aldrich". TFA "Sigma-Aldrich". α-1-антитрипсин "Abcam". Низкомолекулярный ингибитор трипсина PMSF "Sigma-Aldrich". α-циано-4-гидрокси-коричная кислота "Bruker". Деионизированная вода Li Chrosolv "Merck". Пептиды Aβ и их ¹⁵N-содержащие стандарты фирмы "rPeptide".

α2M выделен из сыворотки крови человека гель-фильтрацией и любезно предоставлен сотрудником ФГБУ "НИИ гриппа им. А.А. Смородин-цева" Арамом Шалджяном.

Масс-спектрометрия

Масс-спектры получены с помощью масс-спектрометра Ultraflex II MALDI-ToF/ToF (Bruker Daltonics, Германия), оборудованного Nd:YAG (Neodymium-doped Yttrium Aluminium Garnet; Nd:Y3Al5O12) лазером.

Пептиды детектировали в виде положительных ионов с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты (HCCA) (BrukerDaltonics, Германия). Точность измерения моноизотопных масс была не хуже 50 миллионных долей (ppm).

Растворы пептидов Альцгеймера

Все анализируемые пептиды были растворены в буфере, содержащем 20% ацетонитрила и 1% NH 4 OH. Концентрация пептидов в растворах составляла 23 мкM. ¹⁵N-изотопно-меченные стандарты пептидов Альцгеймера были растворены в 100% DMSO. Концентрация составляла 11.5 мкM.

Получение 18О-изотопно-меченного стандарта пептидов Альцгеймера

Растворы пептидов Альцгеймера в концентрации 23 мкM смешивались с H 2 ¹⁸O, ацетонитрилом и 100% трифторуксусной кислотой в соотношении 1:4:4:1 об. (пептид : H 2 ¹⁸O : ацетонитрил : TFA). Смесь инкубировалась в твердотельном термостате при температуре 50 °C в течение 30 мин для протекания изотопного обмена. После инкубации стандарт оставался в растворе, высушивание не производилось.

Термоактивация пептидов Альцгеймера в TFA

Растворы пептидов Альцгеймера в концентрации 23 мкM смешивались с водой, ацетонитрилом и 100% трифторуксусной кислотой в соотношении 1:4:4:1 об. (пептид : вода : ацетонитрил : TFA). Смесь инкубировалась в твердотельном термостате "Гном" ("ДНК-Технология", Россия) при температуре 50 °C в течение 30 мин.

Термоактивация в растворе матрицы

Растворы пептидов Альцгеймера в концентрации 23 мкM смешивались с раствором матрицы (α-циано-4-гидроксикоричной кислотой) в 70% ацетонитриле с 1% TFA и добавлением 10 нM ок-тил-β-D-глюкопиранозида. Смесь инкубировалась в течение 30 мин при температуре 50 °C.

Термоактивация в буферном растворе

Растворы пептидов Альцгеймера в концентрации 23 мкM смешивались с буфером, в котором они растворены (20% ацетонитрил, 1% NH 4 OH). Раствор инкубировался в течение 30 мин при температуре 50 °C.

Инкубация пептидов Альцгеймера в DMSO

Исходный раствор пептида в буфере (20% ацетонитрила, 1% NH 4 OH) разбавлялся в 10 раз 100% DMSO. Пептид в DMSO выдерживался в течение 4, 24 и 48 ч при температуре 23 °C. Часть раствора пептида, выдержанная в течение 24 и 48 ч, подвергалась инкубированию в течение 1 ч при температуре 50 °C.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТА И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Общее описание

В экспериментах использовался ряд пептидов Альцгеймера. В качестве изотопного стандарта применялись как синтетические их аналоги с изотопом ¹⁵N, так и аналоги с изотопом ¹⁸O, получаемые изотопным обменом с тяжелой водой H 2 ¹⁸O.

Табл. 1. Пептиды, испо л ьзо в анные в экспе ри менте (обо з начен и я, аминоки с лотн ые посл е доват е льнос т и, мо-н о изотоп н ые в е личи н ы м олек у лярн ой м асс ы и отн ош ен и е ин т ен с ивн ос ти сигнал а в м а с с-спе к тре посл е терм ообра ботк и в п ри сутствии TFA к исходному сигналу)

Пепт и ды	Аминокислотная последовательность	Mr	I тер м. /о
Aβ(1–21)*	DAEFRH DS GYEV HHQ KKLVFF	2588.3	1 . 0
Aβ(1–3 8)	DAEFRH DS GYEV HHQ KLVFFAEDVGS N KGAII GLM VG G	4129.0	3 . 1
Aβ(1–4 0)	DAEFRH DS GYEV HHQ KLVFFAEDVGS N KGAII GLM VG G	4327.2	3 . 1
15N-Aβ(1– 40)	VV	4381.2	1 . 0
Aβ(1–4 2)	DAEFRH DS GYEV HHQ KLVFFAEDVGS N KGAII GLM VG G	4511.3	2 . 5
15N-Aβ(1– 42)	VVIA	4567.3	1 . 0
α2М- hum an (705– 7 17)	VGFYESD VM GR	1259.7	1 . 0

Примечан ие : * — анал ог пе п тид а Aβ(1–20)

Поми мо э того на ми был п ол у че н п еп ти дны й ф ра г ме нт Pep-α2M п утем трипсинолиза человеческого α2M. С п и сок ис п ользова н ны х пе п тид о в и от дельн ые х а р ак т ерис т ики представлены в табл. 1.

Полученный нами стандарт с изотопом 18O не является гомогенным, поскольку представляет собой смесь пептидов с разным числом замещенных атомов кислорода, число которых зависит как от продолжительности обмена с тяжелой водой H218O, так и от изотопной чистоты самой воды. В нашем случае не требуется, чтобы стандарт был индивидуальным соединением, а является вполне достаточным, чтобы смесь с разным числом включенных атомов 18O давала в масс-спектре сигналы, не перекрывающиеся с сигналами аналита. В нашем случае статистическое распределение вклада каждого индивидуального компонента в зависимости от числа включенных в его состав атомов 18O приведено на рис. 1. Масс-спектр такого стандарта в смеси с незамещенным пептидом Aβ(1–40) приведен на рис. 2.

Рис. 1. Проце н тное содержание ¹⁸O-з а м е щенных компонентов стандарта в зависимости от чи с ла в к л ю че нн ых в е го состав атомов ¹⁸O

Рис. 2. Изотопное распределение пептида Aβ(1–40) в смеси со стандартом.

а — исходное соотношение; б — соотношение после инкубации пептида в смеси 10% TFA и 40% ацетонитрила в течение 30 мин при температуре 50 °C

Табл. 2. Оценка влияния инкубации пептида Aβ(1–38) в 10% TFA + 40% ацетонитрил при 50 °C на соотношение интенсивностей молекулярных ионов аналита и его стандарта

Проба	Инкубация в 10% TFA + 40% ацетонитрил	Отношение сумм площадей пептид/стандарт
1	–	1.02
2	30 мин, 50 °C	2.99

Вместе с тем выяснилось, что при смешивании эквимолярных количеств анализируемого образца и полученного из него стандарта интенсивность стандарта в спектре оказалась примерно в 3 раза выше интенсивности исходного пептида. Однако если анализируемый образец выдержать в условиях, аналогичных получению стандарта, то его интенсивность вырастет (см. рис. 2, б) и их интенсивности станут равными. В этой связи нами было предпринято детальное изучение этого эффекта как имеющего важнейшее значение для количественного анализа этих пептидов.

Изменение интенсивности сигнала пептида Aβ(1–40) в кислых средах (в присутствии TFA)

Известно, что TFA традиционно используется в составе растворов при приготовлении матриц при масс-спектрометрической детекции пептидов. Кроме того, 10% TFA при повышенной температуре используется для получения 18О-содержащих стандартов пептидов Aβ. В то время как при получении 18О-содержащего стандарта применяются исключительно жесткие условия — высокая концентрация TFA и повышенная температура. Вместе с тем использование TFA при работе с пептидами часто необходимо при масс-спектрометрической детекции (в наших экспериментах около 9% TFA в составе растворителя для матриц). В связи с этим представляло интерес оценить возможность предподготовки проб с использованием достаточной концентрации TFA и в том числе использовать непосредственно предподготовку образцов в матрице при одномоментном присутствии как анализируемого образца, так и его стандарта.

Температурное воздействие на пептид Aβ(1– 40), находящийся в кислой среде, привело к увеличению интенсивности иона пептида относительно стандарта в 2.5 раза (см. табл. 2).

Специальными экспериментами было показано, что одинаковое возрастание интенсивности всех используемых пептидов достигается, начиная с использования 1–2% TFA при инкубации при 50 °C в течение 30 мин для всех образцов, и достигает тех же значений при инкубации в растворе матриц. При этом, как показали дополнительные эксперименты с пептидом, представленные на рис. 3, для достижения аналогичного эффекта увеличения интенсивности можно при этой же температуре ограничиться добавлением TFA в концентрации 1–2%.

Таким образом, при использовании полученного путем изотопного обмена стандарта пептида для получения корректных данных количественного анализа пептидов имеются два пути: либо ввести коэффициент пропорциональности, либо перед масс-спектрометрической детекцией провести термообработку анализируемого образца.

Из полученных результатов два вывода. Первый заключается в том, что интенсивность пептидов при масс-спектрометрической детекции зависит от предобработки анализируемых образцов. В частности, увеличение интенсивности при термостатировании при 50 °C в течение 30 мин в присутствии TFA с концентрацией более 1%. Учитывая, что в состав матрицы входит 7%-я TFA, представляется целесообразным просто термостатировать образец в этом растворе в течение 30 мин. Экспериментально показано, что в этих условиях достигается максимальное увеличение интенсивности, близкое к З.0.

Рис. 3. Изменение в интенсивности при масс-спектрометрическом анализе пептида Aβ(1–38) относительно его стандарта после инкубации пептида в TFA.

По вертикальной оси отложено отношение интенсивности после инкубации к начальной интенсивности

Рис. 4. Способность пептида Aβ(1–40) к ингибированию взаимодействия α2M с трипсином при термостатировании пептида при 50 °C.

■ — активность ингибирования a2M; ▲ — изменение масс-спектрометрической интенсивности иона пептида Aβ(1–40) при термостатировании

Влияние термообработки пептида на активность Aβ(1–40)

В представленном следующем эксперименте проведена термообработка пептида Aβ(1–40) и его триптического гидролизата при 50 оС. Повышение температуры было выбрано из необходимости ускорения процесса, поскольку даже при 50 °C время полуинактивации пептида Aβ(1–40) составляет примерно 24 ч. В связи с этим предстояло оценить устойчивость этого пептида при термообработке при 50 °C в отсутствие DMSO. Результаты этого эксперимента при инкубации пептида при 50 °C представлены на рис. 4.

Из полученных данных следует: при масс-спектрометрической детекции при полном сохранении активности быстро возрастает интенсивность сигнала по отношению к стандарту (растворенному в DMSO), внесенному после термоактивации уже в матрицу (см. Материалы и методы). Этот факт необходимо учитывать при использовании масс-спектрометрии для количественного определения концентраций этих пептидов с использованием изотоп-содержащих стандартов (в представленном выше случае ошибка в определении может составлять порядка 300%).

Влияние термообработки на смесь пептидов Aβ(1–38), Aβ(1–40) и Aβ(1–42)

В тех же условиях была подвергнута термообработке смесь всех трех имеющихся пептидов β-амилоида — Aβ(1–38), Aβ(1–40) и Aβ(1–42) — в надежде, что инкубация смеси этих пептидов в кислой среде позволит выровнять детектируемые интенсивности. Однако на деле соотношение интенсивностей пептидов осталось тем же. Тем не менее детектируемость пептидов от этой операции все же улучшилась, что особенно ценно в отношении пептида Aβ(1–42), интенсивность иона которого обычно мала.

В сравнении со стандартом каждый из пептидов показал одинаковое увеличение интенсивности (табл. 3).

Изменение активности пептида Aβ(1–40) при инкубации в DMSO

DMSO — часто используемый растворитель для гидрофобных пептидов, в том числе и для растворения пептидов Альцгеймера. Именно этот растворитель был использован нами для приготовления растворов 15N-стандарта.

Табл. 3. Изменения в соотношении интенсивностей пептидов Aβ по отношению к стандарту ¹⁸O – Aβ(1–40)

Пептид	Соотношение сумм площадей пептид / стандарт до инкубации	Соотношение сумм площадей пептид / стандарт после инкубации
Aβ(1–38)	1.83	3.63
Aβ(1–40)	0.38	0.70
Aβ(1–42)	0.04	0.08

Экспериментально выяснилось, что стандарты пептидов не обладают способностью ингибировать α2M. В связи с этим нами была проведена проверка влияние DMSO на активность пептида Aβ(1–40). Для этого пептид Aβ(1–40) из буферного раствора (20% ацетонитрил, 1% аммиак) разбавлялся в 10 раз 100%-м DMSO. Пептид с DMSO выдерживался в течение 4, 24 и 48 ч. После этого часть пробы подвергалась дополнительному инкубированию в течение 1 ч при температуре 50 °C.

В качестве контроля количества α2M в сыворотке была подготовлена проба из сыворотки без добавления пептида Aβ(1–40). Вместо пептида добавлялся бикарбонатный буфер. В качестве контроля за протеканием ингибирования была приготовлена проба из сыворотки с добавлением пептида без DMSO. Результаты измерения активности α2M после инкубации с Aβ(1–40), предварительно выдержанным в DMSO, представлены на рис. 4. Как следует из представленных данных, ингибирующая способности пептида Aβ(1–40) существенно снижается со временем и в конечном итоге получается полностью неактивный пептид, что и наблюдается у стандартов, растворенных в DMSO.

Полученные результаты указывают на то, что инкубация пептидов Альцгеймера с DMSO приводит к утрате способности ингибировать взаимодействие α2M с трипсином. Нагревание при этом не оказывает существенного влияния. Подобный результат, возможно, объясняется изменением пространственной структуры пептида. Это согласуется с результатами, ранее полученными при инкубации сыворотки с 15N-изотопно-меченными стандартами пептидов Aβ, которые, будучи растворенными в 100% DMSO, не обладали ингибирующей способностью. Это не противоречит данным по термоактивации пептидов, которая не приводила к утрате ингибирующей способности, но приводила к увеличению интенсивности при масс-спектрометрической детекции.

Показано, что Aβ при выдерживании в растворе DMSO теряет способность связываться с α2M и, соответственно, ингибировать его способность к взаимодействию с протеазами на примере трипсина. Скорость инактивации зависит от концентрации DMSO. Это, в свою очередь, позволило по взаимодействию с α2M предложить метод, дающий количественную оценку содержания пептидов Aβ, способных (активных) или теряющих способность (неактивных) ингибировать α2M.

В качестве примера использования этого подхода на рис. 5 представлен процесс потери ингибирующей способности по отношению к α2M для пептида Aβ(1–38) в растворе, содержащем 20% DMSO.

Рис. 5. Кинетика ингибирования пептида Aβ(1–38) в 20% DMSO

Тот факт, что DMSO дезактивирует возможность Aβ связываться с α2M, позволяет предположить, что такой Aβ теряет способность взаимодействия с теми рецепторами, с которыми он взаимодействует в организме больного. Об этом косвенно свидетельствует и то, что DMSO может служить полезным адъювантом для противодействия Aβ-опосредованной синаптотоксичности [3].

Зависимость масс-спектрометрической детекции пептида Aβ(1–38) от его активности

Влияние состояния пептида Aβ(1–38) на его масс-спектрометрическую детекцию проверялось относительно 15N-стандарта этого пептида. Стандарт растворен в 100% DMSO, и его интенсивность стабильна независимо от проводимых с ним манипуляций.

Небольшой объем каждого из образцов пептида, инактивированного в DMSO, смешивался с равным объемом стандарта и анализировался масс-спектрометрически. В качестве контроля максимального изменения интенсивности был взят не подвергавшийся инкубации в DMSO пептид, который инкубировался в 2.5% TFA (равные объемы раствора пептида и 5% TFA) в течение 30 мин при температуре 50 оС. Все образцы, инкубированные в DMSO, также смешивались с TFA для оцен- ки изменения интенсивности вследствие действия TFA. Для каждого образца было сделано 3 повторных измерения.

У не подвергавшихся действию DMSO образцов наблюдалось увеличение интенсивности в 3 раза относительно неинкубированных в TFA. При этом образцы после воздействия DMSO показали четкую зависимость в изменении интенсивности ионов в зависимости от активности этих пептидов (рис. 6).

Эта зависимость позволяет оценить активность пептида Aβ по интенсивности его сигнала в масс-спектрометре. Для этого достаточно получить масс-спектры образца относительно стандарта без инкубации в TFA и после инкубации. После инкубации в TFA достигается максимальная интенсивность, соответствующая троекратной интенсивности по сравнению с активным пептидом Aβ. Если пептид был частично неактивен, то изменение интенсивности после инкубации в TFA будет меньше 3. В последнем случае делением на 3 изменения интенсивности мы получим активность исследуемого пептида. Например, если после инкубации с TFA изменение интенсивности составило 1.8 раза, то на графике необходимо отложить значение по оси изменения интенсивности 3/1.8 = = 1.67, что соответствует активности 60%.

Рис. 6. Зависимость интенсивности масс-спектрометрической детекции пептида Aβ(1–38) от активности пептида

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Из нашего исследования логически вытекает рекомендация: перед анализом прогревать смесь аналита Aβ со стандартом в присутствии 0.5% TFA, что ведет к денатурации обоих компонентов смеси. Этим способом достигается единообразие их форм, заодно повышая интенсивность их сигналов в масс-спектре.

При анализе необходимо учитывать различную интенсивность сигналов от Aβ(1–38), Aβ(1–40) и Aβ(1–42) — в этом ряду она убывает. Что не позволяет количественно измерить всех их с помощью одного изотопно-меченного стандарта.