Особенности мезоструктуры, пигментного и липидного состава представителей сем. Onagraceae

• 1    Семейство Onagraceae (кипрейные или ослинниковые) включает около 25 родов и до 700 видов растений. Как правило, это многолетние травы, реже кустарники и небольшие деревья. Многие виды этого семейства относятся к адвентивной флоре (Асминг, 2007).

2.    МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Изучению адвентивной флоры в последнее время уделяется большое внимание. Считают, что чужеродные растения чутко реагируют на трансформацию экосистем и приобретают селективные преимущества по сравнению со многими аборигенными видами. Это позволяет им в пределах нового ареала резко повысить свою численность и успешно захватить новые территории. Внедрение адвентивных видов в растительные сообщества снижает биоразнообразие, в результате обедняется их видовой состав и упрощается структура (Ямалов и др., 2013). Управление этими негативными процессами в сообществах является на сегодняшний день актуальной проблемой науки о растительности. Для этого необходимы знания, как об экологии адвентивного вида, так и о его структурно-функциональных особенностях (Broz et al., 2007). Следует отметить, что работ подобного рода, посвященных адвентивным растениям, крайне мало (Shikov et al., 2006).

Цель настоящей работы состояла в исследовании особенностей мезоструктуры, пигментного и липидного состава растений сем. Ona-graceae. В задачу исследования входило также выявление возможной взаимосвязи между ме-зоструктурными параметрами фотосинтетического аппарата и биохимическими характеристиками растений в зависимости от их эколого-ценотической приуроченности и генетического статуса вида.

В качестве объектов исследования были выбраны растения Oenothera biennis L. (ослинник двулетний или энотера двулетняя), Oenothera villosa Thunb. (энотера мохнатая), Chamaene-rion angustifolium (L.) Scop. (иван-чай узколистный), Epilobium adenocaulon Hausskn. (кипрей железистостебельный), Epilobium hirsutum L. (кипрей волосистый). Растения отбирали на территории Сызранской и Ульяновской обл., в первой половине дня в середине июля 2016 г. Для анализов пигментов и липидов использовали листья 15–20 растений. Из усредненной массы составляли три биологические пробы по 0,5–2 г сырой массы. Далее растительный материал фиксировали в жидком азоте при температуре -80ºС.

Содержание фотосинтетических пигментов определяли на спектрофотометре «ПромЭко-Лаб ПЭ_3000 УФ» (Россия) в ацетоновой вытяжке. При длинах волн 662 и 644 нм определяли содержание хлорофилла (Хл а , б ), 470 нм – содержание каротиноидов (Кар) (Maslova et al., 1986).

Липиды экстрагировали смесью хлороформа и метанола (1:2) с одновременным механическим разрушением тканей. Разделение липидов осуществляли методом тонкослойной хроматографии (Кейтс, 1985). Количество фосфолипидов (ФЛ) определяли по содержанию неорганического фосфора, гликолипидов (ГЛ) и нейтральных липидов (НЛ) – денситометрически «Денскан-04» (Ленхром, Россия). Хроматограммы анализировали в режиме параболической аппроксимации по градуировочным зависимостям, используя моногалактозилдиацилг-лицерин (МГДГ) и трипальмитат в качестве стандартов (Гребенкина и др., 2012; Розенцвет и др., 2013).

Для определения мезоструктуры фотосинтетического аппарата растений, из средней части листьев вырезали высечки и фиксировали в 90% спирте, хранили при температуре -20ºС. Мезоструктуру фотосинтетического аппарата определяли согласно методики (Мокроносов, Борзенкова, 1978). Подсчет количества клеток в единице площади листа проводили в камере Горяева, подсчет количества хлоропластов в клетках мезофилла проводили на давленых препаратах согласно методу (Борзенкова, Храмцова, 2006).

Метанолиз жирных кислот (ЖК) осуществляли кипячением в 5 % -ном растворе HCl в метаноле. Полученные эфиры анализировали на хроматографе «Хроматэк Кристалл 5000.1» (Россия) в изотермическом режиме с использованием капиллярной колонки длиной 105 м и диаметром 0.25 мм «RESTEK» (США). Температура колонки – 180 ^о С, испарителя и детектора – 260 ^о С, скорость тока газа-носителя (гелий) – 2 мл/мин.

Статистическую обработку результатов анализов проводили с использованием программ Statistica 6.0 for Windows, Microsoft Excel 2007.

3.    РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе исследованные растения представлены двумя родами – Oenothera и Epilobium . Растения рода Oenothera – O . biennis – произрастают по сухим разбитым пескам, вырубкам, обочинам песчаных дорог, боровым полянам. Распространению вида O . villosa способствовало разведение в садах. Сегодня этот вид можно встретить вдоль автомобильных дорог, на песчаных отмелях в долинах крупных рек, иногда также пойменные луга и заросли кустарников. Изредка произрастает на опушках сухих сосновых лесов. Внедряется во вторичные местообитания, но практически не проникает в нетронутые лесные или луговые сообщества. Являясь пионерным растением техногенных экотопов, вид закрепляет почву и, вероятно, уменьшает интенсивность эрозионного процесса (Черная Книга…, 2016). Оба вида данного рода являются двулетними травянистыми ксеромефитами, с одинаковым ареалом распространения (североамериканский) и генетическим статусом. Эти адвентивные виды относятся к сорным растениям.

Род Epilobium в нашей работе представлен травянистыми многолетниками. Растения C . angustifolium произрастают преимущественно на вырубках, прогалинах в хвойных и смешанных лесах, вблизи канав, на осушенных торфяниках, вдоль железнодорожных насыпей. Растения E . adenocaulon распространены в сообществах открытого типа, на илистых грунтах по берегам водоемов, на болотах, на полянах вдоль троп и лесных дорог, где уничтожен травяной покров. Встречаются также на различных вторичных, антропогенных местообитаниях: у дорог, канав, на железнодорожных откосах, чаще всего можно встретить в сообществах открытого типа, на илистых грунтах по берегам водоемов и в лесах (Скворцов, 1995; Скворцов,

1996). Растения E . hirsutum произрастают по берегам болот, рек.

Растения рода Epilobium различаются по отношению экологической группе, ареалу происхождения и генетическому статусу. Так, по режиму увлажнения C. angustifolium является мезофитом, E. adenocaulon – гигромезофитом, а E. hirsutum – гигрофитом. Растения представляют три разных ареала распространения: голарктический бореально-неморальный, североамериканский, Европейско-западноазиатский плюро-зональный, соответственно. По генетическому статусу C. angustifolium и E. hirsutum являются аборигенными видами, а E. adenocaulon – адвентивным. Все исследованные виды существенно различались по содержанию влаги в надземной части растений. Оводненность листьев растений варьировала в интервале 65,6– 80,2% от сырой массы. У ксеромезофитов, гигромезофитов и гигрофитов, произраставших в более влажных условиях, содержание влаги было примерно равным (72,8–77,1%). Меньше влаги содержали листья мезофитного растения C. angustifolium (65,6%).

Данные мезоструктурного анализа показали, что растений O . biennis имели самое большое число клеток в расчете на единицу площади листа (табл. 1). Объем и площадь поверхности клеток палисадной ткани у растения рода Oenothera были более чем 2 раза выше, чем у растений рода Epilobium . При этом число хлоропластов и их объем в растениях разных родов также различались, но в меньшей степени – не более 30% (27,2–32,5 и 20,0–24,1 тыс. мкм ³ ). Наиболее существенные различия между растениями отмечены по числу хлоропластов на единицу площади листа. Так у растений O . biennis данный показатель был в 8–10 раз больше по сравнению с другими видами. Это способствовало большему клеточному объему хлоропласта (КОХ), а также большим значениям индекса мембран клеток и индекса мембран хлоропластов.

Таблица 1

Параметры мезоструктуры листьев растений родов Epilobium и Oenothera

Параметры	O. biennis	O. villosa	C. angustifo-lium	E . hirsutum	E . adenocau-lon
Число клеток в единице площади (S) листа тыс. 2 см	980,8±8,9	121,6±7,8	160,0±2,6	166,6±4,8	345,5±4,5
Объем клетки П) тыс. 3 мкм	14,3±0,3	13,7±1,7	8,9±0,9	4,1±2,0	6,2±1,2
Площадь   поверхности клетки П тыс. мкм2	3,6±0,6	3,5±0,3	2,8±0,2	1,5±0,5	1,9±0,9
Число ХЛ в клетке тыс. 2 см	31,4±1,4	35,8±1,8	26,1±1,6	23,5±1,5	26,1±1,6
Объем ХЛ тыс. мкм3	27,2±3,0	32,5±2,0	24,1±2,1	23,2±3,2	20,0±4,2
Площадь   поверхности ХЛ тыс. мкм2	45,2±4,5	50,0±2,0	41,2±6,0	39,7±3,5	48,0±3,6
Число ХЛ в единице S 2 листа млн см	30,8±3,0	4,4±3,1	4,2±0,2	3,9±0,9	9,0±1,2
КОХ П, мкм3	455,4±20,0	382,7±4,8	341,0±5,0	174,5±1,7	237,5±3,7
Индекс мембран клеток П см2/см2	35,3±3,0	4,3±1,3	4,5±0,5	2,5±0,5	6,6±1,2
Индекс мембран ХЛ П см2/см2	13,9±2,0	2,2±1,0	1,7±0,7	1,6±0,6	4,3±2,9

Примечание: П – палисадная ткань; ХЛ – хлоропласты; N – число хлоропластов; S – площадь листа; КОХ – клеточный объем хлоропласта.

Известно, что размеры клеток мезофилла, включая палисадную и губчатую ткани, имеют важное значение для интенсивности физиологических процессов листа, поскольку они определяют поверхностно-объемное отношение мезофилла, плотность упаковки тканей, величину межклеточных воздушных пространств и другие параметры важные для диффузии газов и распределения света внутри листа (Иванова, 2012). В частности, у древесных растений наблюдаются мелкие размеры клеток, обуславливающих более плотную упаковку мезофилла, меньший объем воздухоносных межклетников (Pyankov, et al., 1999). Для травянистых растений той же экологической группы (мезофиты), что и древесные растения, характерны большие размеры клеток мезофилла, что позволяет им повысить скорость роста листа растяжением клеток. Травянистые растений сем. Onagracea характеризуются индивидуальными особенно- стями мезоструктуры, что, по-видимому, связано со специализацией видов по эколого-ценотическому и генетическому статусу.

Анализ пигментного фонда показал, что содержание зеленых и желтых пигментов варьировало в широких пределах (2,9–13,1 для хлорофиллов и 0,8–2,6 для каротиноидов мг/г в расчете на сухую массу) (рис. 1). В листьях растений рода Oenothera суммарное содержа-

Рис. 1. Содержание хлорофиллов и каротиноидов в листьях растений родов Epilobium и Oenothera (мг/г сухой массы)

ние пигментов было меньше по сравнению с растениями рода Epilobium в 2 и более раз, несмотря на то, что их клетки были более объемными, содержали больше хлоропластов. Со- держание пигментов менялось в ряду ксероме-зофиты < мезофиты < гигромезофиты < гигрофиты, что дает основание предположить зависимость содержания пигментов от экологического статуса растений, связанного с режимом увлажнения. Однако различий между аборигенными и адвентивными растениями по данному показателю не выявлено.

Рис. 2. Содержание суммарных и индивидуальных липидов в листьях растений родов

Epilobium и Oenothera

Соединения липидной природы и их надмолекулярным клеточным образованиям – биологическим мембранам – отводят важнейшую роль в функционировании основных клеточных биохимических механизмов. Данные механизмы определяют и регулируют физическое состояние клетки, ее взаимодействие, как с соседними клетками, так и внешней средой (Rozentsvet et al., 2016).

Среди суммарных липидов доля полярных липидов, отвечающих структуру мембран – гликолипидов (ГЛ) и фосфолипидов (ФЛ), составляет 25,4–62,1% и 7,6–12,7% от суммы липидов, соответственно. Наибольшее количество полярных липидов отмечено в растениях E . ad-enocaulon (Рис. 2 А). Кроме указанных липидов, в состав мембран входят компоненты, относящиеся к стериновой группе. Общее содержание стеринов варьировало от 1,3 до 3,1 мг/г сухой массы, что составляло от суммы мембранных липидов не более 5%.

Внутренние мембраны хлоропластов растений содержат моногалактозилдиацилглицерин (МГДГ), дигалактозилдиацилглицерин (ДГДГ) и сульфохиновозилдиацилглицерин (СХДГ).

Кроме указанных липидов, в состав мембран хлоропластов, входит единственный ФЛ фос-фатидилглицерин (ФГ). Для всех исследованных видов обнаружено классическое соотношение компонентов ГЛ. Так в листьях растений относительное содержание МГДГ составляло около 50–60 %, ДГДГ – 30–40%, а СХДГ 5–12% от суммы ГЛ (Dörmann, Benning 2002; Sakurai et al., 2007) (Рис. 2 Б). Вклад ФГ в пул ГЛ составлял не более 5% от суммы ГЛ. Сравнивая данные между родами можно видеть, что листья растений рода Epilobium, а именно E. hir-sutum и E. adenocaulon, содержали в 1,5–2,0 раза больше ГЛ, чем растения рода Oenothera. Можно также отметить четкую корреляцию между содержанием липидов в мембранах хлоропластов и содержанием фотосинтетических пигментов (r=0,9 при P < 0.04). Содержание и тех и других компонентов увеличивается в ряду ксеромезофиты – мезофиты –гигромезофиты – гигрофиты. В качественном составе липидов, представленных фосфатидилхолином (ФХ), фосфатидилэтаноламином (ФЭ), фосфатидилг-лицерином (ФГ), фосфатидилинозитом (ФИ) и отвечающих за структуру непластидных мембран, также не выявлено каких-либо особенностей в исследованных видах. В количественном отношении показано большее содержание ФХ у растений E. adenocaulon (Рис. 2 В).

Физические свойства мембран в большой степени определяются уровнем ненасыщенности ЖК. Среди ЖК исследованных растений было идентифицировано 14 компонентов (табл. 2). Как и предполагалось, на долю кислот с длиной углеводородной цепи 16 и 18 атомов углерода приходилось 90–98% от суммы ЖК. В составе насыщенных ЖК преобладает пальмитиновая кислота С 16:0. В листьях исследованных растений ее содержание составляло от 15,7 до 20,6% от суммы ЖК. Среди ненасыщенных ЖК доминирует линоленовая кислота (С 18:3n3), за ней следуют линолевая и олеиновая кислоты (С 18:2n6 и С 18:1n9). Содержание С 18:3n3 у растений E . hirsutum и E. adenocaulon было выше ~на 30%, по сравнению с другми видами. Индекс ненасыщенности (ИН) ЖК варьировал в интервале значений 1,8–2,3 и был больше у растений E . hirsutum и E . adenocaulon .

Таблица 2

Жирнокислотный состав листьев растений родов Epilobium и Oenothera

Кислоты	O. biennis	O. villosa	C. angustifolium	E. hirsutum	E. adenocaulon
С 14:0	1,8±0,8	1,4±0,2	2,9±0,4	1,1±0,2	1,1±0,1
С 16:0	18,9±0,9	18,3±0,1	20,6±0,3	15,9±0,5	15,7±0,1
С16:1	2,3±0,3	2,9±0,6	1,7±0,4	2,9±0,5	2,6±0,4
С18:0	2,1±0,1	2,4±0,2	2,5±0,2	2,6±0,3	2,0±0,2
С 18:1n9	2,4±0,3	1,7±0,4	3,1±0,1	1,1±0,1	1,2±0,1
С 18:2n6	19,0±0,2	16,6±0,3	12,9±0,5	7,9±0,5	6,7±0,5
С 18:3n3	51,8±0,4	54,7±0,4	51,6±0,3	65,7±0,4	69,7±0,4
С 20:0	0,9±0,3	0,8±0,4	2,5±0,2	1,5±0,2	1,0±0,1
Другие кислоты	0,4±0,2	0,6±0,2	1,9±0,6	0,3±0,1	0,5±0,1
Индекс ненасыщенности	1,9	2,0	1,8	2,2	2,3

Рис. 3. Степень родства биохимических признаков растений родов Epilobium и Oenothera по данным кластерного анализа

Следует отметить, что Е. adenocaidon может превосходит по численности многие другие виды, заселяющие пионерные местообитания – Tussilago farfara , Chamaenerion angustifolium и Epilobium montanum (Myerscough, Whitehead, 1966) благодаря способности прорастать при низких (10°С) температурах, низком уровне освещения, а также в засушливых условиях. Не исключено, что эти свойства обеспечиваются большей эффективностью фотосинтеза за счет большего содержания фотосинтетических пигментов, локализованных в мембранах хлоропластов, а также более гибкими мембранами, обеспечивающими большую мобильность функциональных комплексов фотосинтетического аппарата за счет большей ненасыщенности ЖК.

Кроме измерения структурных и биохимических параметров, была предпринята попытка установить взаимосвязь между исследованными биохимическими параметрами и генетическим статусом видов (рис. 3). Это позволяет оценить экологический потенциал растений, способность адаптироваться в разнообразных условиях.

Для кластерного анализа были использованы все измеренные биохимические показатели, такие как содержание зеленных и желтых пигментов, а также содержание отдельных компонентов мембранных и запасных липидов. По данным рис. 3 можно видеть, что наибольшей геометрической близостью характеризовались растения рода Oenothera, в листьях которых было отмечено наименьшее содержание пигментов и липидов. Близость результатов между данными видами связана с одинаковой эколого-ценотической приуроченностью, к тому же оба вида относятся к адвентивным растениям. В следующем кластере объединены растения видов E. hirsutum и E. adenocaulon, несмотря на то, что они имеют разный генетический статус. На дендрограмме положение вида C. angustifo-lium находится между кластерами растений Oenothera и Epilobium.

Полученные данные позволяют заключить, что параметры мезоструктуры определяются видовыми особенностями, в то время как биохимические показатели имеют определенное межвидовое сходство. На основании измеренных показателей растений сем. Onagraceae, каких-либо особенностей, характеризующих растения как представителей адвентивной или аборигенной флоры, не выявлено.