Особенности пролиферации и апоптоза эпителиоцитов толстой кишки крыс после облучения в дозе 8 гр

Саакян С.В., Каракаева Э.Б-Г., Шаповалова Е.Ю., Зорин И.А., Демяшкин Г.А. Особенности пролиферации и апоптоз эпителиоцитов толстой кишки после облучения электронами в дозе 8 Гр. Морфологические ведомости. 2023;31(3):790. mn.2023.31(3).790

Saakian SV, Karakaeva EB-G, Shapovalova EY, Zorin IA, Demyashkin GA. Eatures of proliferation and apoptosis of colonic epitheliocytes after electron irradiation at a dose of 8 Gy. Morfologicheskie Vedomosti – Morphological newsletter. 2023;31(3):790. (3).790

Введение. Эпителиальные клетки толстой кишки характеризуются высокой митотической активностью. Считается, что они обладают повышенной радиочувствительностью ко всем видам излучения, причем не только к локальному (тазовоабдоминальному), но и к общему облучению [1-2]. Влияние радиоизлучения на эпителиальные стволовые клетки кишечных крипт было подробно изучено в предыдущих работах других авторов. Известно, что инициация постлучевого гастроинтестинального синдрома происходит вследствие повреждения клеток кишечных крипт и сопровождается отеком, гиперемией, слущиванием эпителия, изъязвлениями, стриктурами и некрозом стенки кишки [3]. Ионизирующее излучение вызывает повреждение клеток и субклеточных структур. Аберрации ДНК приводят к нарушению сигнальных внутриклеточных путей, ответственных за нормальное функционирование жизненного цикла, инициацию апоптоза и репарацию молекул генетической информации [4-5].

Активация апоптоза происходит, как в условиях клеточного и тканевого гомеостаза, так и при разных патологических состояниях, таких как ишемия, неврологические нарушения, неоплазии и различные инфекции, а также при повреждениях ДНК [4]. В настоящий момент известны два механизма, которые активируют апоптоз в клетках. Внутренний путь, регулируемый митохондриями и внешний, индуцированный лигандами клеточной гибели. Эти лиганды способны индуцировать инициаторные протеазы, такие как каспаза-9, что приводит к активации терминальной протеазы - каспазы-3 [6]. В немногочисленных исследованиях было показано, что каспаза-3 является ключевой молекулой при активации апоптоза в эпителиоцитах толстой кишки после воздействия облучения. После повреждения ДНК запускается внутренний путь апоптоза, приводящий к высвобождению проапоптотических молекул и увеличению проницаемости митохондрий, что в свою очередь запускает активность терминальных молекул, таких как каспаза-7 и -3 [7-8].

В современной морфологии и радиологии отсутствует информация о воздействии электронов на слизистую оболочку толстой кишки, несмотря на перспективность и активное внедрение этого вида излучения для терапевтической практики в онкологии. Данные о воздействии других видов облучения на толстую кишку, в основном используемых в лучевой терапии, - противоречивы [2, 9-10]. В этом смысле морфологическое и молекулярно-биологическое исследования эффектов облучения электронами является актуальным, так как установлено, что оно обладает меньшим повреждающим эффектом на ткани [11]. В то же время при изучении влияния облучения электронами на эпителий толстой кишки важно оценить не только степень и глубину повреждений, но и пролиферативную активность эпителиоцитов, то есть их регенеративный потенциал.

Цель исследования: иммуногистохимическая оценка пролиферации и апоптоза эпителия толстой кишки после локального облучения электронами в дозе 8 Гр в эксперименте.

Материалы и методы исследования. В эксперименте использованы половозрелые крысы-самцы линии Вистар (n=30), которые были поделены на две группы: I - контрольная (n=10); II - опытная группа (n=20). Локальное однократное облучение электронами в дозе 2 Гр тазовоабдоминальной области производили на линейном ускорителе NOVAC-11 при мощности дозы 1 Гр/мин, энергии 10 МэВ и частоте 9 Гц, с диаметром поля облучения 100 мм. Животных каждой группы выводили из эксперимента на 1 и 3 сутки. Все манипуляции выполняли согласно «Международным рекомендациям по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (ЕЭС, Страсбург, 1985) и Хельсинской декларации (1985).

Фрагменты толстой (ободочной) кишки фиксировали в забуференом формалине, заливали в парафиновые блоки, гистологические срезы нарезали на микротоме толщиной 3 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином. Микроскопический анализ выполняли с помощью систе- мы видеомикроскопии микроскопа Leica DM2000 (Германия), видеокамерой Leica ICC50 HD. Ключевые периоды жизненного цикла эпителия толстой кишки изучены с помощью маркеров терминации апоптоза (каспазы-3) и пролиферации (Ki-67). Иммуногистохимическое исследование проводили по стандартному протоколу в автоматическом режиме в иммуногистостейнере Bond-Max («Leica», Германия). Первичные антитела: к каспазе-3 (Invitrogen/Thermo Fisher Scientific; 74T2, 1:50) и Ki-67 (Abcam; ab15580, 1:100); вторичные – универсальные антитела (HiDef Detection™ HRP Polymer system, «Cell Marque», США). Количество иммунопози-тивных клеток подсчитывали в 10 полях зрения, при увеличении х400. Полученные данные были представлены в виде относительного числа позитивных клеток в %, как среднее значение доли (P) и ошибки средней доли (pm). Значимыми считали различия между показателями при p≤0,05.

Результаты исследования и обсуждение. Во всех гистологических препаратах толстой кишки животных через сутки после локального облучения электронами в дозе 8 Гр наблюдали типичную морфологическую картину постлучевого колита, которая проявлялась в дезорганизации однослойного цилиндрического эпителия с апоптотическими тельцами и воспалительной инфильтрации в подслизистой основе, слабом интерстициальном отеке. Количество бокаловидных клеток было снижено, а сами кишечные крипты расширены. На 3-и сутки эксперимента отмечали восстановление гистоархитектоники эпителия слизистой оболочки толстой кишки, расположение и строение кишечных крипт, количество бокаловидных клеток приблизилось к контрольным значениям. При иммуногистохимическом исследовании через сутки после локального облучения электронами выявили преобладание апоптотических процессов. Количество каспаза-3-позитивных клеток было увеличено в 1,56 раза в опытной группе по сравнению с контрольной с до 33,5% до 52,5% (табл. 1). Количество Ki-67-позитивных клеток, напротив, было после облучения снижено в 1,54 раза с 49% до 31,2%. На 3-и сутки после облучения элек- тронами в эпителии толстой кишки количество иммунопозитивных клеток статистически не отличалось от контрольных значений (табл. 1, рис. 1).

Таблица 1

Доля позитивно окрашенных к антигенам энтероцитов в гистологических препаратах толстой кишки контрольной и опытных групп крыс в % (P±p m )

Маркер	Группа II (облучение)		Группа I (контроль)
	1 сутки	3 сутки
Сaspase-3	52,4715,13 '	39,6113,27	33,4812,35
Ki-67	31,212,97 ;	43,6214,73	49,2714,53

Примечание: ↑ - статистически значимое увеличение и ↓ -уменьшение по сравнению с контрольной группой

Электронотерапия является перспективным методом, обладающим терапевтическим эффектом при кратковременном облучении в высоких дозах, что значительно сокращает число осложнений по сравнению с лечением традиционными видами излучения. Значительная частота заболеваемости колоректальным раком и отсутствие данных об эффективности его лечения электронным излучением, как потенциальной альтернативы другим видам радиотерапии, стимулируют его экспериментальные исследования [11-12]. В проведенном эксперименте установлено, что эпителий толстой кишки обладает высокой радиочувствительностью, о чем свидетельствует морфологическая картина постлучевого колита, обнаруженная уже на первые сутки после облучения тазовоабдоминальной зоны крыс. Это явление подтверждает ранее проведенные исследования по аналогичным эффектам других видов ионизирующего излучения [1315]. В эксперименте было обнаружено, что уже на первые сутки после облучения электронами в эпителии значительно возрастает количество каспаза-3-позитивных клеток. Можно полагать, что результатом прямого воздействия электронов на энте-роциты толстой кишки является фрагментация ДНК и клеточных мембран, запуск апоптоза, завершающийся активацией каспазы-3 [7, 16]. Увеличение количества активированной каспазы-3 приводит к прекращению жизненного цикла энтеро-цитов. Наиболее интенсивно окрашенными на каспазу-3 были клетки, располагающиеся в области дна крип, являющиеся стволовыми для кишечного эпителия и обладающие, как известно, высокой митотической активностью (рис. 1).

Иммуногистохимические маркеры

Сaspase-3

8 Гр 1-е сутки

Ki-67

8 Гр 3-и сутки

контроль

Рис. 1. Микрофото гистологических препаратов толстой кишки крыс после локального однократного облучения электронами в дозе 8 Гр. Окр.: иммуногистохимическая (см. в тексте) с докраской ядер гематоксилином. Ув.: ×200

Известно, что при вступлении в апоптоз энтероциты толстой кишки способны выделять молекулы, которые стимулируют сохранные стволовые клетки к ускоренной пролиферации [17-18]. Поэтому, наряду с указанным выше на первые сутки эксперимента эффектом облучения электронами, отмечали снижение количества Ki-67-позитивно окрашенных клеток в области дна кишечных крипт.

Однако уже на 3 сутки показатели пролиферации в опытной группе приблизились к значениям контрольной группы. Для восстановления пула эпителиоцитов кишечных крипт в такие кратчайшие сроки, очевидно вполне достаточно сохранившегося количества интактных стволовых клеток.

Заключение. Таким образом, при локальном однократном облучении элек- тронами тазово-абдоминальной области крыс Вистар в дозе 8 Гр через сутки отмечается снижение количества стволовых эпителиальных клеток кишечных крипт в толстой (ободочной) кишке, что подтверждается сдвигом пролиферативно-апоп-тотического баланса в сторону гибели клеток, оцененного соотношением каспа- зы-3 и Ki-67. В динамике, на третьи сутки эксперимента, наблюдается увеличение пула стволовых клеток с последующим восстановлением кишечных крипт.