Особенности пролиферативной активности эпителиоцитов семенников крыс при дефиците магния

Микро и макро-элементы играют важную роль в организме человека. Одним из ключевых макроэлементов является магний, который входит в состав абсолютно всех тканей и клеток и принимает участие в важнейших обменных процессах [3]. Дефицит этого макроэлемента может привезти к различным заболеваниям таким, как ишемическая болезнь сердца, гипертония, заболевания нервной системы, язвенная болезнь желудка и др. [2, 4, 7]

В настоящее время в литературе имеются данные о влиянии магния на пролиферативную активность клеток репродуктивной системы [1]. Одним из маркеров для определения так называемой «фракции роста клеточной популяции» является белок KI-67, по экспрессии которого можно исследовать пролиферативную активность. Ki-67 был впервые идентифицирован как антиген в ядрах клеток лимфомы Ходжкина. Кi-67 – это ядерный антиген, ген которого расположен на длинном плече 10 пары хромосомы. Данный белок экспрессируется во всех фазах митоза и в синтетическом периоде [6].

Функции белка Кi-67 хорошо описаны на молекулярном уровне, что дает возможность использования данного белка в качестве достоверного маркера для выявления всего пула пролиферирующих клеток [5]. Однако структурнофункциональные изменения семенников при дефиците магния изучены недостаточно.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Целью настоящего исследования явилось изучение пролиферативной активности клеток в фазе размножения сперматогенеза у крыс, находящихся на магний-дефицитной диете.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 20 нелинейных половозрелых крысах-самцах, массой 250–300 г.

Все процедуры с животными в исследовании проводились в соответствии с общепринятыми этическими нормами обращения с животными, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (1986) и с учетом Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997).

Перед началом исследования все животные были разделены на 2 группы: контрольная и опытная. Контрольная группа (n = 10) получала полноценное питание, включающее кормовую смесь для содержания лабораторных животных (ООО «ТПК Альянс», Россия), зерно-продукты, сочные корма (овощи и травы) и отстоянную воду. Опытная группа (n = 10) с целью моделирования алиментарного дефицита магния в течение 12 недель получала диету с добавлением полиминеральной смеси без солей магния AIN-76 (МPBiomedicals. Ohyo, США) и очищенную от солей воду. При этом обе группы животных содержались в одинаковых условиях. Ежедневно проводили оценку-общего состояния и измеряли массу тела (г). Через 12 недель проводили измерение уровня магния в плазме крови и эритроцитах спектрофотометрическим методом по цветной реакции с титановым желтым [1].

Для проведения гистологического исследования забор материала проводили путем вырезания продольных и поперечных фрагментов, включающих все оболочки семенников крысы. Полученный материал фиксировали в 4%-м растворе нейтрального забуференного формалина (pH = 7,4) в течение 24 часов. Далее производили заливку в парафиновые блоки по общепринятым гистологическим методикам с последующим изготовлением парафиновых срезов толщиной 3–5 мкм и окраской гематоксилином и эозином.

Гистологическое исследование проводили путем подсчета общего количества клеток сперматогенного эпителия.

Иммуногистохимическое исследование выполняли с первичными кроличьими моноклональными антителами к белку Ki-67 [клон SP6], с детекцией хромогеном-диаминобензидином, по общепринятым методикам. Характер иммуногистохимической реакции оценивали визуально и определяли удельное количество позитивно окрашенных клеток стандартизирован- ными методами морфометрии в иммуногистохимии (Dabbs D. J., 2018). Оценку пролиферативной активности производили путем подсчета удельного количества Ki-67-позитивных клеток к общему количеству клеток сперматогенного эпителия (%).

Микрофотосъемку гистологических препаратов проводили в случайных полях зрения с помощью микроскопа «AxioScope» (CarlZeiss, Германия). Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Microsoft office Excel 2007 (Microsoft, США) и GraphPad (тесты).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведенного исследования была выполнена оценка пролиферативной активности клеток в зоне размножения семенников крыс гистологическим и иммуногистохимическим методами.

При гистологическом анализе зоны размножения семенников крыс на срезах в контрольной группе количество ядер клеток спер-матогенного эпителия составило 13816 ± 690,8. На срезах животных с дефицитом магния данный показатель был равен 40371 ± 310,5, что достоверно превосходило группу интактного контроля на 65,8 % (см. табл., рис. 1).

С целью уточнения полученных данных пролиферативная активность клеток зоны размножения семенников была изучена более избирательным иммуногистохимическим методом. В результате на срезах обеих групп животных определялась Ki-67-позитивная ядерная экспрессия антигена преимущественно в зоне размножения. На микропрепаратах интактных животных Ki-67-позитивные клетки определялись в количестве 7086 ± 354,3, а на срезах семенников магний-дефицитных крысих уровень составил 32684 ± 251,4, что статистически значимо на 78,4 % превышало значение контрольных данных (см. табл., рис. 2).

Морфометрические показатели пролиферативной активности клеток в зоне размножения семенников крыс, находящихся на магний-дефицитной диете гистологическим методом и иммуногистохимическим методом с антителами к белку Ki-67 (М ± м) (n = 10)

Экспериментальные группы	Общее количество ядер клеток (М ± м)	Общее количество Ki-67 позитивных клеток (М ± м)	Индекс пролиферации, %
Контрольная группа	13816 ± 690,8	7086 ± 354,3	51,28
Опытная группа	40371 ± 310,5*	32684 ± 251,4*	80,96

* Данные достоверны относительно контроля. Р < 0,05. Примечание: n-число микропрепаратов в группе.

а

Рис. 1. Микропрепараты срезов семенников интактных крыс (а) и крыс с дефицитом магния (б). Окраска гематоксилином и эозином. Ув. ×400

б

а                                                   б

Рис. 2. Микропрепараты срезов семенников интактных крыс (а) и крыс с дефицитом магния (б). Иммуногистохимическая реакция с антителами к протеину Ki-67. Докраска гематоксилином. Ув. ×400

При расчете индекса пролиферативной активности его среднее значение в контрольной группе животных составило 51,28 %, во второй экспериментальной группе – 80,96 %, что свидетельствовало о достоверном увеличении клеток, находящихся на разных фазах митоза по отношению к группе интактных животных (см. табл.).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в результате проведенных исследований показано, что при гистологическом и иммуногистохимическом (с использованием маркера пролиферации К-67) методах изучения пролиферативной активности клеток зоны размножения семенников крыс, находившихся в течение 12 недель на магний-дефицитной дие- те, количество ядер эпителиоцитов достоверно в 2,9 и 4,6 раза соответственно превосходило данный показатель на срезах интактных групп.

Полученные данные позволяют предположить, что отсутствие магния в организме крыс повышает адаптационные механизмы репродуктивной системы к данному состоянию, что проявляется увеличением пролиферативной активности эпителиоцитов в семенниках животных.