Особенности реагирования антиоксидантных ферментов в органах крыс на нарушение циркадианных ритмов на разных этапах онтогенеза

Чередование дня и ночи является важнейшим регулятором временнόй организации физиологических функций организма. Реакция организма на изменение световых режимов обусловлена работой эпифиза (шишковидного тела) [2], который является железой, запускающей процесс старения. Показано, что пересадка эпифиза старых мышей молодым является причиной ускоренного старения последних [12], а его удаление может приводить как к преждевременному старению, так и к продлению жизни. Было установлено, что эпифизэктомия в 14-месячном возрасте, в отличие от более ранних или более поздних возрастов, приводит к увеличению продолжительности жизни млекопитающих [13].

Наряду с удалением железы для изменения деятельности эпифиза используют постоянное освещение. Согласно гипотезе «циркадианной деструкции», воздействие света в ночные часы, как и удлинение светового дня, нарушают эндогенный суточный ритм организма, что приводит к изменению адаптационных реакций, отражается на состоянии здоровья и продолжительности жизни животных [7], [15].

Свободнорадикальная теория старения предполагает, что свободные радикалы, к которым относятся и некоторые активные формы кислорода (АФК), вызывают повреждение макромолекул, что в конечном счете приводит к старению [10]. Обнаружено, что продолжительность жизни животных отрицательно коррелирует с уровнем основного метаболизма и аутоокисляемостью тканей [1], [14]. Одним из способов защиты клеток от действия АФК является повышение (восстановление) ак-

тивности антиоксидантных ферментов (АОФ), в том числе и в результате их синтеза de novo [9].

Целью нашего исследования было изучение влияния постоянного освещения, воздействие которого начиналось в возрасте 1 и 14 месяцев, на активность АОФ – супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы, а также продолжительность жизни крыс.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыт проводили на самцах и самках крыс, содержавшихся на стандартном рационе вивария со свободным доступом к воде. Были сформированы 3 группы животных: первая содержалась в стандартных условиях освещения в течение всей жизни (12 часов свет / 12 часов темнота; LD) и являлась контрольной, вторая и третья – при постоянном освещении с возраста 1 месяца (LL-1) и 14 месяцев (LL-14) соответственно. Группы LD и LL-1 состояли из 5 животных (соотношение самцов и самок 2:3), в группе LL-14 было 6 крыс (3:3).

У крыс первых двух групп (LD и LL-1) образцы тканей печени, почек, сердца, легких, селезенки и скелетной мышцы отбирали после декапитации в 6, 12, 18 и 24 месяца, у животных третьей группы (LL-14) – в 15, 18, 24 и 30 месяцев. Определение активности ферментов проводили спектрофотометрически: СОД по модифицированной адренохромной методике [11], каталазы – по количеству разложенной перекиси водорода [8]. Оценивали различные показатели, характеризующие продолжительность жизни в каждой из групп: среднюю продолжительность жизни (СПЖ), СПЖ последних 10 % крыс и максимальную продолжительность жизни (МПЖ) животных. Полученные данные обрабатывали общепринятыми методами вариационной статистики. Сравнение показателей у крыс одного возраста проводили попарно (LD – LL-1, LD – LL-14 и LL-1 – LL-14) с применением непараметрического критерия Вилкоксона – Манна – Уитни [5]. Работа выполнена с соблюдением международных принципов Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным, принципов гуманности, изложенных в директиве Европейского сообщества (86/609/ЕС), «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных», «Биоэтических правил проведения исследований на человеке и животных».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Ранее нами было показано, что у крыс, которые с месячного возраста содержались в условиях постоянного освещения, активность АОФ возрастала до определенного уровня, а затем постепенно или резко, в зависимости от органа, снижалась – происходило «старение» ферментативного компонента антиоксидантной системы [3], [4]. Особенно отчетливо эти изменения проявлялись в сердце, почках и скелетной мышечной ткани.

В настоящем исследовании установлено, что с возрастом происходит в разной степени выражен- ное рассогласование в работе ферментов антиоксидантной системы у крыс первых двух групп. В печени и почках отмечено снижение активности СОД к 12 месяцам с последующим увеличением к 18-месячному возрасту, тогда как активность каталазы, наоборот, повышалась у 12-месячных крыс и снижалась к 18 месяцам. Активность СОД в этих органах у 12-месячных крыс имела минимальное значение, а каталазы – максимальное (рис. 1, 2). В отличие от этого, у крыс, содержавшихся при постоянном освещении с 14 месяцев, отмечены синхронные изменения активности ферментов – при увеличении активности СОД увеличивалась и активность каталазы. Активность СОД и каталазы печени и почек у этой группы животных по сравнению с крысами первых двух групп повышалась к 24-месячному возрасту и затем снижалась к 30 месяцам (рис. 1, 2).

Рис. 1. Возрастные изменения активности СОД в органах крыс, содержавшихся в различных режимах освещения: LD – стандартное освещение, LL-1 – постоянное освещение с месячного возраста, LL-14 – постоянное освещение с 14 меся-цев; * – различия достоверны по сравнению с животными, содержавшимися при LD, ◊ – различия достоверны по сравнению с животными, содержавшимися при LL-1

В сердечной мышце крыс, содержавшихся в условиях стандартного и постоянного освещения с месячного возраста, активность СОД снижалась уже к 12-месячному возрасту и сохранялась на одном уровне в течение дальнейшей жизни. У крыс, находившихся в группе LL-14, активность этого фермента, начиная с 18 месяцев,

Рис. 2. Возрастные изменения активности каталазы в органах крыс, содержавшихся в различных режимах освещения: Условные обозначения, как на рис. 1

резко увеличивалась, и среднее ее значение к 30 месяцам более чем в 7 раз превышало таковое у 15-месячных животных (рис. 1). Активность каталазы в сердце крыс группы LL-1 несколько увеличивалась к 18 месяцам, тогда как активность этого фермента у крыс группы LL-14 повышалась к 24 месяцам (рис. 2).

У крыс, находившихся с месячного возраста при постоянном освещении, снижение активности СОД в селезенке происходило уже к 12 месяцам, а в легких – к 18 месяцам. Изменение активности этого фермента в легких и селезенке у животных, с 14 месяцев находившихся при постоянном освещении, имело V-образный характер с минимумом в 24 месяца (рис. 1). Активность каталазы в легких у 30-месячных крыс, подвергавшихся воздействию постоянного освещения с 14 месяцев, находилась на уровне 24-месячных животных, с месячного возраста содержавшихся при постоянном освещении. Отмечено, что сезонные изменения активности каталазы (повышение в весенний период и снижение осенью) в селезенке, характерные для крыс в группах LD и LL-1, исчезают при содержании крыс в условиях постоянного освещения с 14 месяцев (рис. 2).

Активность СОД в скелетной мышце крыс, содержавшихся в стандартных световых условиях и при постоянном освещении с месячного возраста, постепенно увеличивалась до 18 месяцев, а затем резко снижалась к 24-месячному возрасту (рис. 1).

В скелетных мышцах крыс в группе LL-14 были отмечены сезонные колебания активности СОД с повышением в 18 и 30 месяцев. Активность каталазы в разных группах практически не различалась, но у крыс третьей группы отмечалось усиление активности в 30-месячном возрасте (рис. 2).

Полученные данные по активности ферментов хорошо согласуются с показателями продолжительности жизни экспериментальных животных. Установлено, что выживаемость как самцов, так и самок крыс, находившихся в группе LL-1, была значительно ниже (на графиках кривые их выживаемости смещены влево), чем у крыс в группах LD и LL-14 (рис. 3). Кроме того, указанные животные характеризовались более низкой средней (самки – на 22,1 %, самцы – на 3 %) и максимальной продолжительностью жизни (самки – на 18 %, самцы – на 4 %) по сравнению с крысами, находившимися при стандартном освещении (см. таблицу).

Кривые выживаемости самцов и самок в группе LL-14 сходны с таковыми у крыс в группе LD (рис. 3). СПЖ самок, с 14 месяцев находившихся при постоянном освещении, на 4 % ниже, а МПЖ на месяц больше, чем у самок крыс при стандартном освещении. У самцов в группе LL-14 показатели продолжительности жизни были выше по сравнению с животными, находившимися в стандартных световых условиях. Показатели продолжительности жизни как самцов, так и самок в группе LL-14 превышают таковые у крыс, содержавшихся при постоянном освещении с месячного возраста (см. таблицу).

Рис. 3. Выживаемость самцов (А) и самок (Б) крыс, содержавшихся в различных режимах освещения. Условные обозначения, как на рис. 1

Влияние различных режимов освещения на продолжительность жизни самцов и самок крыс

Показатели		Световой режим
		Стандартное освещение (LD)	Постоянное освещение (LL-1)	Постоянное освещение (LL-14)
3 и	Количество крыс	57	50	88
	СПЖ, сут.	766 ± 25,3	744 ± 28,0	818 ± 18,0
	МПЖ, сут.	1045	1005	1198
	СПЖ последних 10 % крыс, сут.	994 ± 9,2	1002 ± 1,8	1087 ± 8,3*
S 2 сЗ и	Количество крыс	40	54	59
	СПЖ, сут.	844 ± 33,6	658 ± 22,8*	811 ± 20,0
	МПЖ, сут.	1167	956	1198
	СПЖ последних 10 % крыс, сут.	1129 ± 18,9	921 ± 19,7	1113 ± 24,9

Примечание. * – различия достоверны по сравнению с животными в группе LD (p < 0,01).

ОБСУЖДЕНИЕ

Таким образом, снижение активности АОФ, свидетельствующее о «старении» системы в органах крыс, с 14 месяцев содержавшихся в условиях постоянного освещения, происходило позже (в 24 месяца), чем у животных, которые находились при стандартном и постоянном освещении с месячного возраста. Активность как СОД, так и каталазы в большинстве органов 24месячных крыс группы LL-1 была ниже по сравнению с животными того же возраста группы LL-14. Изменение активности АОФ в период постнатального развития, которое наблюдалось у крыс, содержавшихся при постоянном освещении с 14 месячного возраста, согласуется с увеличением их продолжительности жизни. Полученные результаты позволяют утверждать, что воздействие постоянного освещения может приводить не только к сокращению продолжительности жизни крыс, как это было показано в работе И. А. Виноградовой и коллег [16], но и спо- собствовать увеличению выживаемости животных. Фактором, обусловливающим эти различия, как и в ранее проведенных экспериментах на мышах [13], является срок начала экспериментальных воздействий. Так, при удалении эпифиза на разных этапах постнатального онтогенеза (3, 5, 7, 9, 14 и 18 месяцев) отмечалось либо сокращение, либо удлинение продолжительности жизни животных [13]. Эпифизэктомия в 14месячном возрасте приводила к значительному увеличению выживаемости мышей и поддержанию их гормонального и метаболического статуса на уровне 5-месячных животных. Авторы считают, что именно в этом возрасте эпифиз запускает «программу» старения организма. Воздействие постоянного освещения с 14 месяцев у крыс и эпифизэктомия в этом возрасте у мышей [13] оказывают сходное влияние на продолжительность жизни животных. Нами установлено, что у самок крыс, находившихся в группе LL-14, СПЖ, МПЖ и СПЖ последних 10 % животных и МПЖ самцов этой группы достоверно выше, чем у крыс, содержавшихся при стандартном и постоянном освещении с возраста 1 месяца. СПЖ и МПЖ крыс, содержавшихся при постоянном освещении с месячного возраста, были значительно ниже по сравнению с животными других групп.

Проведенное исследование является еще одним подтверждением свободнорадикальной теории старения, выдвинутой Д. Харманом [10] и Н. М. Эмануэлем [6] более полувека назад. Воздействие подавляющего функциональную активность эпифиза постоянного освещения с 14месячного возраста способно приводить к более позднему «старению» ферментативного компонента антиоксидантной системы крыс, что, возможно, является одной из причин продления жизни животных, а также подтверждением предположения Уолтера Пиерпаоли о ключевой роли эпифиза в запуске «программы» старения организма [13].

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 07-04-00546) и Гранта Президента РФ НШ–3731.2010.4.