Особенности ремоделирования сосудистого сплетения IV желудочка головного мозга и мозжечка крыс в зависимости от рациона кормления

Введение. В последние годы нейробиоло-гические исследования вскрыли ряд схожих физиологических функций сосудистых сплетений головного мозга (ССГМ) и мозжечка. Так, установлено, что ССГМ и клетки Пуркинье (КП) коры мозжечка экспрессируют мор- фоген Sonic hedgehog (Shh), активно участвующий в эмбриональном развитии головного мозга и церебрального сосудистого русла [1, 2]. Shh наряду с другими факторами роста способствует развитию и росту нервных стволовых клеток и кортикальных эксплантов [3].

Сосудистое сплетение IV желудочка головного мозга является производным эпителиальной инвагинации однослойной кровельной пластинки заднего мозга [4]. У взрослого человека и крысы сосудистое сплетение IV желудочка состоит из многоярусной капиллярной сети, расположенной в выростах соединительной ткани, покрытых одним слоем кубического эпителия – ворсинок (рис. 1).

Мозжечок, как и сосудистое сплетение IV желудочка, является производным заднего мозга. В процессе гистогенеза наружный слой мозжечка формируется путем миграции матричных клеток эпендимного слоя нервной трубки по отросткам радиальных глиоцитов. От наружного слоя клетки мигрируют в обратном направлении, по пути дифференцируясь в нейробласты и встречаясь с нейробластами следующей волны миграции из эпендимного слоя. Миграция двух потоков нейробластов по мере созревания приводит к формированию молекулярного, ганглионарного и зернистого слоев коры мозжечка и образованию внутренних межнейрональных связей (рис. 2).

25 мкм

Рис. 1. Сосудистое сплетение IV желудочка головного мозга интактной крысы: 1 – капилляры сосудистого сплетения;

2 – ворсинка;

3 – кубический эпителий ворсин.

Окраска гематоксилин-эозином, ув. 400

Рис. 2. Мозжечок интактной крысы:

1 – молекулярный слой;

2 – ганглионарный слой;

3 – зернистый слой.

Окраска гематоксилин-зозином, ув. 400

Fig. 1. Choroid plexus of the fourth ventricle of rat cerebrum:

• 1    – choroid plexus capillaries;

• 2    – villus;

• 3    – cuboidal villi epithelium.

Hematoxylin-eosin staining, magnification 400×

Fig. 2. Cerebellum of an intact rat:

• 1    – molecular layer;

• 2    – ganglion layer;

• 3    – granular layer.

Hematoxylin-eosin staining, magnification 400×

Сосудистое сплетение IV желудочка и мозжечок имеют не только общие источники происхождения, но и общее кровоснабжение и иннервацию. Так, сосудистое сплетение IV желудочка состоит из средней, косо-продольной и продольной частей, которые образованы передними и задними ветвями IV желудочка, отходящими от передней и задней нижних мозжечковых артерий. Общность иннервации заключается в том, что сосудистое сплетение IV желудочка, как и кровеносные сосуды мозжечка, иннервируются симпатиче- скими волокнами верхнего шейного и звездчатого узлов симпатического ствола и парасимпатическими – блуждающего нерва. Чувствительная иннервация осуществляется ветвями тройничного нерва [5].

Сосудистое сплетение IV желудочка из крови, притекающей по ветвям артерий мозжечка, вырабатывает цереброспинальную жидкость (ЦСЖ), лишенную видовой и тканевой специфичности и наделенную широким спектром функций. Вопрос о механизмах продукции ЦСЖ интригует ученых в течение сто- летий и по настоящее время окончательно не решен. Однако точно установлен факт переноса Na+, HCO3-, Cl- и H2O из крови в ЦСЖ и K+ в обратном направлении. В этом процессе принимает участие широкий спектр транспортеров, экспрессируемых на базальной (Na+-K+ATF, ряд котранспортеров) и апикальной (Kv- и Kir-каналы) мембранах эпителия сосудистого сплетения [6].

Ранее ЦСЖ рассматривалась как среда, обеспечивающая механическую поддержку мозга, способствующая удалению продуктов метаболизма, доставляющая отдельные нутриенты, а также служащая каналом связи внутри центральной нервной системы (ЦНС). В настоящее время доказано, что факторы-резиденты ЦСЖ влияют на широкий спектр поведения, включая сон и аппетит, а также на циркадные ритмы и связанную с ними двигательную активность животных [7].

Не менее интересны новые данные, полученные относительно физиологии мозжечка. Традиционно мозжечок рассматривался как орган приспособления организма к преодолению основных свойств массы тела – тяжести и инерции [8]. В настоящее время установлена роль мозжечка в регуляции сенсорной обратной связи моторных команд [5–9]. При этом кора мозжечка кодирует сенсомоторную адаптацию во время целенаправленного осознанного двигательного поведения, хотя точная взаимосвязь между симпатической передачей информации и поведением не ясна [5]. Мозжечок координирует точное движение глаз [10–12], а КП принимают участие в активном акте моргания [13, 14]. Мозжечок моделирует рефлекс мочеиспускания и участвует в обработке сенсорной информации мочевого пузыря [15]. В последние годы показана важная роль мозжечка в обучении [16], обработке звуков, т.е. в различении высоты тона и тембра [17]. С нарушением функции мозжечка связаны трудности в обучении у большинства детей с аутизмом [18].

Важнейшей составляющей жизнедеятельности человека и животных является питание. От количества и качества потребляемой пищи зависит физическое, психическое и социальное здоровье индивида. Существует масса разнообразных диетических подходов в профилактике и лечении заболеваний: кетодиета, детокс-диета, кремлевская диета, раздельное питание и т.п. Однако нельзя отрицать, что организм нуждается в ежедневном усвоении полного арсенала биологических соединений: белков, жиров, углеводов, витаминов и минеральных веществ. И выпадение каких-либо биомолекул из рациона питания может привести к определенным структурным и физиологическим изменениям в организме. Так называемое белое вещество головного мозга, или миелин, до 70 % состоит из липидов (фосфолипидов и холестерина), которые передают импульсы изолированно, организуя выполнение точных, координированных движений; 30 % миелиновой оболочки приходится на белки, которые в свою очередь выполняют каркасную функцию, а также участвуют в транспорте глюкозы, витаминов, минералов.

Однообразный рацион питания может отразиться на функционировании структур головного мозга и реологических свойствах крови в системе микроциркуляторного русла мозга.

Цель исследования. Оценить особенности ремоделирования сосудистого сплетения IV желудочка и ангиоархитектоники мозжечка крыс, содержащихся на исключительно белковом и жировом рационах кормления.

Материалы и методы. Работа выполнена на 15 белых беспородных крысах-самцах массой 200–250 г с соблюдением правил лабораторной практики, утвержденных приказом Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 23 августа 2010 г. № 708 Н «Об утверждении правил лабораторной практики». Протокол исследований одобрен локальным этическим комитетом при НПО «Профилактическая медицина» МЗ КР (протокол № 1 от 5.10.2020).

Перед экспериментом животных разделили на 3 группы: 1-ю группу (n=5) составили интактные крысы, содержащиеся на стандартном корме; во 2-ю (n=5) вошли животные, потреблявшие исключительно жир (курдючное сало); 3-ю группу (n=5) составили крысы, которых кормили куриным яичным белком. На 15-й и 30-й дни опыта животных выводили из эксперимента путем передозировки хлороформа с последующей декапитацией. Производили забор крови из полостей сердца для последующей оценки уровней холестерина, глюкозы, общего белка и альбумина в сыворотке крови. Определение биохимических показателей производили энзиматическим колориметрическим методом с использованием тест-систем Vital (Россия).

Голову животного, освобожденную от мягких тканей, погружали на 3 дня в 10 % нейтральный раствор формалина. Затем головной мозг с мозжечком изымали из черепа, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, заливали в парафин. Материалом исследования стали сосудистое сплетение IV желу- дочка головного мозга и мозжечок. Из парафиновых блоков готовили фронтальные серийные срезы толщиной 5–7 мкм, которые окрашивали гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону. Готовые гистологические препараты изучали под микроскопом Olympus Bх40 (Япония) с одновременным фотографированием с помощью цветового фотоаппарата Levenhuk C130 NG (КНР) и протоколированием. Полученные результаты обрабатывали в программе SPSS 16.0, достоверность различий определяли по критерию Стьюдента при p<0,05.

Результаты и обсуждение. Содержание холестерина, глюкозы, общего белка и альбумина в сыворотке крови животных всех трех групп представлено в табл. 1.

Таблица 1

Table 1

Показатели Parameter	1-я группа (интактные) Group 1 (intact)	2-я группа (жировая диета) Group 2 (high-fat diet)	3-я группа (белковая диета) Group 3 (high-protein diet)
Холестерин, ммоль/л Cholesterol, mmol/l	1,16±0,04	4,78±0,03*	2,06±0,12
Глюкоза, г/л Glucose, g/l	1,67±0,04	2,02±0,04*	1,9±0,13
Общий белок, г/л Total protein, g/l	61,16±4,94	55,6±0,50	103,9±12,9*
Альбумин, г/л Albumin, g/l	24,9±3,1	48,3±13,3*	36,6±3,17*

Примечание. * – достоверные отличия между группой контроля и сравниваемыми группами (p<0,05).

Note. * – the difference is significant compared with the control group (p<0.05).

Биохимические показатели сыворотки крови крыс Biochemical parameters of blood serum in rats

Как следует из табл. 1, при исключительно жировой диете, по сравнению с группой контроля, в сыворотке крови крыс уровень общего холестерина увеличился в 4,7 раза, на 20 % возрос уровень глюкозы и в 2 раза повысился уровень альбумина (p<0,05). У животных, находящихся на исключительно белковой диете, уровень общего белка сыворотки крови возрос на 69 %, при этом уровень альбумина увеличился на 46 % (p<0,05).

Механизм поставки жирных кислот в клетку включает в себя три этапа. Первый – это диссоциация жирных кислот с белковым компонентом, второй – транспорт через плазматическую мембрану, третий – связывание их с внутриклеточными белками и/или этерификация [19]. Вполне возможно, что гипе-ральбуминемия у крыс, содержащихся на жировом рационе, детерминирована первым этапом поставки жирных кислот в клетку. Диссоциация жирных кислот с альбуминовым комплексом вполне способна вызвать гиперальбу-минемию. Отсутствие углеводов в рационе кормления крыс сопровождается уменьше- нием запаса гликогена в печени, что вызывает усиленное поступление жирных кислот в нее. Развивается жировая дистрофия печени [20]. На этом фоне снижается глюконеогенез и содержание глюкозы в крови нарастает.

Высокие концентрации в крови холестерина, глюкозы и альбумина отражаются на гемореологии и микрогемоциркуляции в сосудистом сплетении IV желудочка. Независимо от сроков эксперимента отмечается спазм сосудов ворсинок сосудистого сплетения IV желудочка. Капилляры сосудистого сплетения IV желудочка включают в себя фенестрированный эпителий, базальную мембрану, перициты и рядом залегающие гладкомышечные клетки. Данное обстоятельство свидетельствует о возможности регуляции кровотока через сосуды ворсин при помощи воздействия на гладкомышечные клетки [21]. Следовательно, под действием нейрогуморальных факторов сосуды ворсин вполне могут подвергнуться спазму [22]. Однако вопрос о физиологическом значении спазма сосудов ворсин сосудистого сплетения IV желудочка остается открытым независимо от сроков эксперимента.

У животных, содержащихся на исключительно жировой диете, стенка капилляров ворсин на 15-й день опыта характеризуется утолщением базальной мембраны, просветлением цитоплазмы, набуханием ядер, что дополнительно уменьшает просвет сосудов. Содержание капилляров изменчиво: одни сосуды содержат эритроциты, другие – плазму, третьи – пустые.

На 30-й день отмечается нарушение целостности капиллярной стенки и кровоизлияние в просвет IV желудочка головного мозга (рис. 3).

Рис. 3. Кровоизлияние в полость IV желудочка головного мозга крысы, находящейся на исключительно жировой диете (30-е сут): 1 – ворсинка сосудистого сплетения

IV желудочка головного мозга;

2 – эпендимоциты;

3 – участок кровоизлияния.

Окраска гематоксилин-эозином, ув. 400

Fig. 3. Hemorrhage into the fourth ventricle of rat cerebrum, 30-day high-fat diet:

• 1    – choroid plexus villi of the fourth ventricle of cerebrum;

• 2    – ependymocytes;

• 3    – hemorrhage area.

Hematoxylin-eosin staining, magnification 400×

Рис. 4. Сосудистое сплетение IV желудочка крысы с признаками мутного набухания эпендимоцитов (жировая диета, 30-е сут):

1 – полость IV желудочка головного мозга;

2 – эпендимоциты.

Окраска гематоксилин-эозином, ув. 400

Fig. 4. Choroid plexus of the fourth ventricle of rat cerebrum with cloudy ependymocyte swelling (30-day high-fat diet):

• 1    – the fourth ventricle of cerebrum;

• 2    – ependymocytes.

Hematoxylin-eosin staining, magnification 400×

Нежная, рыхлая, состоящая из коллагеновых и в небольшом количестве эластических волокон соединительная ткань у экспериментальных животных уплотняется и грубеет. Это приводит к стиранию границ между соседними ворсинками сосудистого сплетения IV желудочка уже начиная с 15-го дня эксперимента. На 30-й день в отдельных случаях из-за отека соединительнотканная основа сосудистого сплетения IV желудочка становится оптически менее плотной и расстояние между ворсинками выглядит расширенным (рис. 4).

Эпендимоциты – структурно-функциональные единицы ворсинок сосудистого сплетения IV желудочка, выполняющие барьерную (гематоликворную и секреторную) функцию [23]. На 15-е сут кормления жиром эпен-димоциты становятся более плоскими, складчатость на базолатеральной поверхности сглаживается, расстояние между ними и капиллярами сокращается, площадь соприкосновения увеличивается. Надо полагать, что это компенсаторная реакция, направленная на облегчение секреции СМЖ на фоне спазма сосудов. На 30-е сут отмечается мутное набухание эпендимоцитов, что свидетельствует о деструкции крист [22]. В отдельных экземплярах отмечается просветление нуклеоплазмы, кариолема приобретает волнистые очертания. Описанные изменения могут выступать в качестве структурных эквивалентов нарушения секреторной функции эпендимоцитов.

Артерии и вены, проходящие по гребням извилин мозжечка, в большинстве случаев полнокровные, без признаков гемореологических нарушений. Редко встречаются экземпляры, содержащие гравитационно расслоенную на форменные элементы и плазму кровь. Со стороны сосудистой стенки наблюдается вакуолизация медии, повышенная извитость внутренней эластической мембраны. От сосудов в направлении основания извилин спускаются артериальные ветви, а в обратном направлении поднимаются венозные притоки. Между сосудами, расположенными по обеим поверхностям извилин, визуализируются анастомозы. Благодаря последним обеспечиваются окольное кровоснабжение и перемежающаяся активность отдельных звеньев микрогемоциркуляции. При выраженном спазме и закупорке одних отмечается полнокровие других сосудов. Так как корковое вещество располагается на периферии извилин, то кора по сравнению с белым веществом находится в привилегированном положении. Однако, несмотря на это, со стороны клеток разных слоев коры встречаются как приспособительные, так и патологические реакции.

В молекулярном слое концентрация корзинчатых и звездчатых нейронов снижается. Надо полагать, что их тормозящее влияние на клетки Пуркинье усилено. Последние увеличиваются в размерах, часто имеют зернистую протоплазму с признаками хроматолиза в ядрах. В зернистом слое концентрация клеток-зерен и клеток Гольджи не подвергается заметным изменениям. Изложенная картина дополняется большим количеством клубочков мозжечка, наличием светлых промежутков между телами и дендритными клетками Пуркинье. Возможно, активация клубочков мозжечка свидетельствует о повышении возбуждающего действия клеток-зерен в противоположность тормозящему влиянию клеток Гольджи на клетки Пуркинье. В результате этого клетки Пуркинье ожидаемо находятся в состоянии гиперфункции и подвергаются гипертрофии.

Сосудистое сплетение IV желудочка у крыс, которых кормили исключительно куриным яичным белком (рис. 5), находится в состоянии гиперемии, что является ярким отличием от группы контроля, а также животных, которые употребляли в пищу исключительно жир. Капилляры ССГМ у животных 3-й группы дилатированы, полнокровные, хорошо визуализируются в поле зрения микроскопа. Эпендимоциты, окружающие капилляры, увеличены в размерах, их патологические изменения обнаружить не удается.

20 мкм

20 µm

Рис. 5. Сосудистое сплетение IV желудочка головного мозга крысы, находящейся на исключительно белковом рационе кормления (30-е сут):

1 – дилатированные, гиперемированные капилляры ворсинок сосудистого сплетения головного мозга;

2 – ворсинка сосудистого сплетения головного мозга;

3 – эпендимоциты.

Окраска гематоксилин-эозином, ув. 400

Fig. 5. Choroid plexus of the fourth ventricle of rat cerebrum, 30-day high-protein diet: 1 – dilated, hyperemic capillaries of the villi of the cerebrum blood vessel plexus;

• 2    – villus of the cerebrum blood vessel plexus;

• 3    – ependymocytes.

Hematoxylin-eosin staining, magnification 400×

25 мкм

25 µm

Рис. 6. Мозжечок крысы, находящейся на исключительно белковом рационе питания (30-е сут):

1 – молекулярный слой мозжечка;

2 – зернистый слой мозжечка;

3 – ганглионарный слой мозжечка;

4 – клетки Пуркинье;

5 – полнокровие сосудов мозжечка.

Окраска гематоксилин-эозином, ув. 400

Fig. 6. Rat cerebellum, 30-day high-protein diet: 1 – molecular cerebellum layer;

• 2    – granular cerebellum layer;

• 3    – ganglion cerebellum layer;

• 4    – Purkinje cells;

• 5    – congestion of cerebellar vessels.

Hematoxylin-eosin staining, magnification 400×

Корзинчатые клетки молекулярного слоя мозжечка эктопируются в сторону ганглионарного слоя и отличаются более светлой окраской, чем в группе контроля. Количество звездчатых клеток в поле зрения микроскопа уменьшается. Клетки Пуркинье подвергаются гипертрофии и гиперплазии, о чем свидетельствует 2–3-рядная топография и расположение между рядами клеток глии и зернистого слоя.

Ремоделирование сосудистого сплетения IV желудочка и мозжечка в ответ на диету как один из ключевых факторов экспозома обусловлено взаимодействием звеньев оси «нейрон – астроцит – кровеносный сосуд», которое вовлекается в регулирование локального кровотока в зависимости от активности конкретной области головного мозга [22], в нашем случае сосудистого сплетения IV желудочка и мозжечка. По данным литературы, величина соот- ношения между глиальными и нервными клетками отражает динамику развития нервной ткани и может быть использована для оценки уровня морфологических изменений. Авторы установили, что увеличение количества глиальных клеток при интоксикации свинцом и черепно-мозговой травме является приспособительной реакцией, направленной на поддержание жизнеспособности нейронов [23].

В наших опытах белковая и жировая диеты вызывают увеличение размеров и количества астроцитов во всех слоях коры и белом веществе мозжечка. В отдельных случаях наблюдается образование так называемых бочонков отростками астроцитов вокруг нейритов нейронов и капилляров. Универсальный ответ астроцитов на кормление животных белком и жиром может быть связан с тем, что обе диеты относятся к кетогенным. Иначе го- воря, ремоделирование астроцитов выступает структурным проявлением, реакцией напряжения их на кетогенную диету как один из ключевых факторов экспозома.

Это отличается от реакции кровеносного русла как одного из звеньев оси экспозома «нейрон – кровеносный сосуд – астроцит», когда при белковой диете отмечается гиперемия, а при жировой – признаки ишемии мозжечка и сосудистого сплетения IV желудочка. На этом фоне клетки Пуркинье при жировой диете подвергаются гипертрофии, при белковой – гиперплазии и гипертрофии. Отмеченные особенности ремоделирования клеток сосудистой стенки, астроцитов и нейронов мозжечка, скорее всего, связаны со своеобразием их метаболизма.

Заключение. Концентрация холестерина, глюкозы и альбумина в сыворотке крови крыс, содержащихся на жировом рационе кормления, выше, чем при белковом и стандартном питании. Исключительно жировой рацион питания приводит к ремоделированию базальной мембраны, просветлению цитоплазмы, набуханию ядер, спазму стенки капилляров сосудистого сплетения IV желудочка с явлениями кровоизлияний к 30-му дню эксперимента, а также хроматолизу ядер клеток Пуркинье. Исключительно белковый рацион питания характеризуется гиперемией сосудистого сплетения IV желудочка головного мозга и мозжечка, а также гипертрофией и гиперплазией клеток Пуркинье. Таким образом, жировой рацион кормления вызывает более выраженные изменения сосудистого сплетения IV желудочка головного мозга и коры мозжечка, чем белковый.