Особенности содержания некоторых гормонов и рецепторов в опухоли и перифокальной зоне у самок мышей BALB/C NUDE с первично-множественным злокачественным процессом, развивающимся на фоне первичного иммунодефицита

Введение. Известно, что у онкологических больных на 10 % повышен риск развития дополнительных первичных злокачественных новообразований других органов [1]. Эти так называемые первично-множественныe злокачественные образования (ПМЗО) не являются метастазами, а представляют собой новые первичные опухоли с различным гистогене- зом [2]. ПМЗО могут быть вызваны различными внутренними, внешними, генетическими и терапевтическими факторами, также ключевую роль может играть общая этиология злокачественных образований [3]. Для пациентов с предшествующим раком в анамнезе определение опухолевого происхождения второго злокачественного поражения имеет большое прогностическое и терапевтическое значение и по-прежнему представляет собой сложную научную и клиническую проблему [4]. В целом у пациентов с синхронными опухолями выживаемость меньше, чем у пациентов с метахронными опухолями [5]. Механизмы возникновения ПМЗО и коморбидные заболевания, способствующие их развитию, до конца не изучены. Одним из факторов может являться угнетение работы иммунной системы.

Первичный иммунодефицит характеризуется рецидивирующими и часто опасными для жизни инфекциями, аутоиммунитетом и раком и представляет собой серьезную диагностическую и терапевтическую проблему [6]. Хотя наиболее тяжелые формы имеют место в раннем детстве, большинство пациентов поступает в зрелом возрасте, как правило, без явного семейного анамнеза и вариабельного клинического фенотипа широко распространенной иммунной дисрегуляции: около 25 % пациентов имеют аутоиммунное заболевание (преобладает аллергия), до 10 % - злокачественные новообразования [7]. Среди патологий, связанных с первичным иммунодефицитом, особое внимание уделяется раку. Рак при первичном иммунодефиците возникает из-за внутренней неспособности регулировать генетическую нестабильность и трансформацию клеток во время дифференцировки из-за измененного иммунного надзора [8]. Несколько крупных когортных исследований, проведенных в различных частях мира, показали повышенный относительный риск развития рака при первичном иммунодефиците [9].

Иммунодефицитный статус животных-реципиентов является обязательным условием для предотвращения отторжения опухолевого материала другого биологического вида, в связи с чем в настоящее время разработано большое количество линий мышей, характеризующихся различной степенью дефектов иммунной системы [10, 11].

Экспериментальные модели опухолей дают возможность выяснить причины и механизмы опухолевого процесса, разработать методы профилактики и лечения рака [14, 15].

Цель исследования. Изучение уровня пролактина, половых гормонов и их рецепторов в ткани и перифокальной зоне меланомы В16/F10 и карциномы легкого Льюиса (LLC) при самостоятельном и сочетанном росте у самок мышей с Т-клеточным иммунодефицитом.

Материалы и методы. Экспериментальные исследования проводили на 8-9-недельных самках мышей линий BALB /c Nude и BALB/c массой тела 21-22 г. Все исследования проводились в соответствии с требованиями и условиями, изложенными в Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных и приказе Минздрава России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики». Работа с животными осуществлялась в соответствии с правилами Европейской конвенции о защите животных, используемых в экспериментах (Директива 2010/63/EU). Протокол экспериментального исследования был одобрен Комиссией по биоэтике ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России от 01.09.2020 (протокол этического комитета № 21/99).

Основной особенностью линии BALB/c Nude является то, что у животных отсутствует вилочковая железа и они не способны продуцировать Т-клетки. Это обусловливается мутацией в гене FOXN1 , который является особенно важным для развития тимуса и некоторых иммунных реакций, особенно опосредованных Т-клетками. Животные не могут создавать эффективный иммунный ответ, поэтому данная линия широко используется для изучения различных типов опухолей. Линия является фенотипически безволосой также вследствие мутации в гене FOXN1 . Животные были получены из филиала «Андреевка» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий» ФМБА (Московская область).

В работе использовали мышиную метастазирующую в легкие меланому В16/F10 и карциному Льюиса (карцинома легких LLC), полученные из РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН (г. Москва).

Животные были распределены на группы: интактные мыши BALB/c Nude (7 шт.); 2 контрольные группы – мыши со стандартной подкожной перевивкой меланомы В16/F10 (7 шт.), мыши с подкожной перевивкой карциномы Льюиса (7 шт.); основная группа – животные с сочетанной перевивкой карциномы Льюиса и меланомы В16/F10 (7 шт.) (ПМЗО).

Самкам мышей линии BALB/c Nude под кожу спины чуть ниже правой лопатки вводили 0,5 мл взвеси опухолевых клеток мышиной меланомы В16/F10 в физиологическом растворе в разведении 1:20, с другой стороны чуть ниже левой лопатки подкожно вводили 0,5 мл опухолевой взвеси LLC, содержащей 0,5 млн опухолевых клеток.

Для исследования через 10 дней роста опухолей проводили забой животных, на льду выделяли первичную опухоль, ее перифокальную зону, кожу, не пораженную злокачественным процессом. Из тканей получали 1 % цитозольные фракции, приготовленные на 0,1 М калий-фосфатном буфере рН 7.4, содержащем 0,1 % Твин-20 и 1 % БСА. Методом ИФА в го- могенатах тканей определяли содержание свободной формы тестостерона (Тсв.), эстрона (Е1), пролактина (ПРЛ), рецепторов эстрогенов – REα и REβ, рецепторов андрогенов (RA) и рецепторов прогестерона (RP4) (Cassabio, Китай).

Статистическую обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере посредством программы Statistica 10.0 с использованием параметрического критерия Стьюдента и непараметрического критерия Вилкоксона – Манна – Уитни. Статистически значимыми считали различия при р<0,05.

Результаты. Динамика роста опухоли и продолжительность жизни животных при В16/F10 и LLC в самостоятельном варианте не имели достоверных отличий (табл. 1). При сочетанном варианте меланома имела более агрессивный характер роста по сравнению с самостоятельным: на 15-е сут она была в 2,8 раза больше, на 22-е – в 1,8 раза (р<0,05). LLC при сочетанном варианте, напротив, име ла меньший объем, чем при самостоятельном: на 15-е сут – в 2,2 раза, на 22-е – в 2,3 раза.

Таблица 1

Table 1

Tumor volumes and life span of nude mice with MPMTs

Объект исследования Study object	Меланома В16/F10, n=7 В16/F10 melanoma, n=7	Карцинома Льюиса, n=7 Lewis lung carcinoma, n=7	ПМЗО, n=7 MPMT, n=7
			Меланома В16/F10 В16/F10 melanoma	Карцинома Льюиса Lewis lung carcinoma
Объем опухолей на 15-е сут, см3 Tumor volume, Day 15, cm3	0,82±0,22	0,94±0,13	2,31±0,54 р1=0,000000	0,42±0,11 р1=0,000000 р2=0,000000 р3=0,000000
Объем опухолей на 22-е сут, см3 Tumor volume, Day 22, cm3	3,90±0,86	4,74±0,80	6,89±0,94 р1=0,000000	2,03±0,21 р1=0,000000 р2=0,000000 р3=0,000000
Продолжительность жизни, сут Life span, days	26,00±0,58	28,67±0,33	22,67±0,88 р1=0,005356 р2=0,000007

Примечание. р¹ – значимость отличий по сравнению с изолированным ростом меланомы, р² – значимость отличий по сравнению с изолированным ростом карциномы Льюиса, р³ – значимость отличий карциномы Льюиса от меланомы в модели ПМЗО.

Объем опухолей и продолжительность жизни мышей с ПМЗО

Note. р¹ – the differences are significant compared with isolated melanoma growth, р² – the differences are significant compared with isolated Lewis lung carcinoma growth, р³ – the differences between Lewis lung carcinoma and MPMT-modelled melanoma are significant.

Изучение гормонов и рецепторов в ткани меланомы В16/F10 самок при различных вариантах роста показало более высокий уровень Е1 (в 2,2 раза) в ткани опухоли при самостоятельном варианте роста по сравнению с сочетанным (табл. 2). При этом уровень Тсв. и ПРЛ оказались ниже – в 1,5 (р˂0,05) и 2,2 раза соответственно. Уровни рецепторов гормонов в ткани меланомы В16/F10 самок не имели достоверных различий при разных вариантах роста опухоли. В перифокальной зоне опухоли при самостоятельном варианте роста меланомы уровень Е1 был выше в 8,8 раза, чем при сочетанном, уровень ПРЛ и Тсв., напротив, в 2,3 и 1,5 раза ниже. При этом уровни рецепторов гормонов REα и REβ не имели значимых отличий в зависимости от варианта роста меланомы, а уровни RA и RP4 при самостоятельном варианте были в 2,2 и 2,5 раза выше.

Поскольку меланома является злокачественным новообразованием кожи, мы изучили не пораженную процессом кожу самок мышей при различных вариантах роста. Показатели в ткани непораженной кожи при различных вариантах роста меланомы сравнили не только между собой, но и со значениями в ткани кожи интактной группы (табл. 2).

Таблица 2

Table 2

Содержание гормонов и рецепторов в опухоли, перифокальной зоне и коже при росте меланомы В16/F10 в самостоятельном и сочетанном с LLC вариантах у самок мышей

Levels of hormones and receptors in the tumor, peritumoral area and skin in female mice with B16/F10 and B16/F10+LLC

Показатели Parameters	Кожа Skin			В16/F10		В16/F10+LLC
	Интактная Intact	В16/F10	В16/F10+ LLC	Опухоль Tumor	Перифокальная зона Peritumoral area	Опухоль В16/f10 В16/f10 tumor	Перифокальная зона В16/F10 В16/F10 peritumoral area
Е1, пг/г тк. Е1, pg/g of tissue	66,2±7,1	1692,8±153,8 Р1=0,000000	561,5±49,3 Р1=0,000000 Р2=0,000000	213,1±23,2	517,3±51,1	95,0±8,4 Р2=0,000000	59,1±6,3 Р2=0,000000
Тсв., пг/г тк. Tf, pg/g of tissue	0,2±0,02	0,3±0,046 Р1=0,000001	0,4±0,055 Р1=0,000000	0,2±0,02	0,2±0,019	0,3±0,031 Р2=0,000000	0,3±0,033 Р2=0,000000
ПРЛ, нг/г тк. PRL, ng/g of tissue	1,3±0,16	0,6±0,07 Р1=0,000000	6,1±0,5 Р1=0,000000 Р2=0,000000	1,6±0,17	3,2±0,35	3,5±0,42 Р2=0,000000	7,2±0,8 Р2=0,000000
REα, нг/г тк. REα, ng/g of tissue	2,2±0,26	4,4±0,5 Р1=0,000000	4,8±0,53 Р1=0,000000	3,4±0,37	7,1±0,7	3,2±0,35	6,6±0,8
REβ, нг/г тк. REβ, ng/g of tissue	2,1±0,23	4,1±0,42 Р1=0,000000	5,7±0,6 Р1=0,000000 Р2=0,000000	3,6±0,48	6,2±0,68	4,4±0,4	7,6±0,7
RA, нг/г тк. RA, ng/g of tissue	0,2±0,021	1,6±0,18 Р1=0,000000	1,0±0,1 Р1=0,000000 Р2=0,000033	0,6±0,07	2,4±0,26	0,5±0,043	1,1±0,1 Р2=0,000000
RP4, нг/г тк. RP4, ng/g of tissue	0,2±0,019	1,6±0,14 Р1=0,000000	2,9±0,3 Р1=0,000000 Р2=0,000000	0,9±0,085	2,7±0,3	1,0±0,09	1,1±0,09 Р2=0,000000

Примечание. Статистически значимые различия по отношению: р¹ – к показателю в интактной коже; р² – к показателю при самостоятельном варианте роста опухоли.

Note. р¹ – the differences are statistically significant compared with the index in the intact skin; р² – the differences are significant compared with the isolated tumor growth variant.

Было установлено, что уровень Е1 превышал показатели в ткани интактной кожи при самостоятельном варианте роста опухоли в 25,6 раза, а при сочетанном варианте – в 8,5 раза, при этом уровень Е1 в ткани кожи, не пораженной опухолевым процессом, при одиночном варианте роста опухоли был в 3 раза выше, чем при сочетанном варианте. Уровень Тсв. при одиночном варианте роста опухоли превышал показатели в ткани интактной кожи в 1,5 раза (р˂0,05), при сочетанном варианте – в 2 раза и не имел достоверных отличий при различных вариантах роста меланомы. Уровень ПРЛ при одиночном варианте роста опухоли был в 2,2 раза ниже показателя в ткани интактной кожи, а при сочетанном варианте уровень гормона превышал показатели в ткани интактной кожи и ткани кожи при одиночном варианте роста в 4,7 и 10,2 раза соответственно. Уровень всех рецепторов гормонов в незатронутой ткани при различных вариантах роста меланомы был выше, чем в ткани интактной кожи: REα при одиночном росте меланомы – в 2 раза, при сочетанном варианте – в 2,2 раза; REβ – в 2 и 2,7 раза соответственно; RA – в 8 и 5 раз соответственно; RP4 – в 8 и 14,5 раза соответственно. При этом уровень RA в ткани кожи при одиночном варианте роста меланомы был выше, чем при сочетанном, в 1,6 раза (р˂0,05), уровни REβ и RP4 были ниже в 1,4 (р˂0,05) и 1,8 раза (р˂0,05) соответственно, а уровни REα не имели достоверных отличий.

Изучение гормонов и рецепторов в опухоли и перифокальной зоне LLC у самок при различных вариантах роста показало более высокий уровень Е1 (в 3,3 раза, р˂0,05), REα (в 1,7 раза, р˂0,05), REβ (в 1,4 раза, р˂0,05) и RP4 (в 3 раза, р˂0,05) в ткани опухоли при самостоятельном варианте роста (табл. 3).

Таблица 3

Table 3

Содержание гормонов и рецепторов в опухоли и перифокальной зоне LLC при самостоятельном и сочетанном с меланомой вариантах роста

Levels of hormones and receptors in the tumor and peritumoral area in female mice with LLC and B16/F10+LLC

Показатели Parameters	LLC		В16/F10+LLC
	Опухоль Tumor	Перифокальная зона Peritumoral area	Опухоль LLC LLC tumor	Перифокальная зона LLC LLC peritumoral area
Е1, пг/г тк. Е1, pg/g of tissue	171,1±21,4	517,0±48,5	51,8±5,3 р1=0,000000	55,9±4,6 р1=0,000000
ТСТ, св. пг/г тк. Tf, pg/g of tissue	0,2±0,018	0,2±0,016	0,3±0,027 р1=0,000000	0,2±0,018
ПРЛ, нг/г тк. PRL, ng/g of tissue	3,0±0,031	12,5±1,4	3,7±0,4	1,6±0,18 р1=0,000000
REα, нг/г тк. REα, ng/g of tissue	2,2±0,25	10,3±1,4	1,3±0,15 р1=0,000002	5,4±0,6 р1=0,000000
REβ, нг/г тк. REβ, ng/g of tissue	4,6±0,53	12,3±1,5	3,4±0,3 р1=0,000007	7,4±0,6 р1=0,000000
RA, нг/г тк. RA, ng/g of tissue	0,3±0,03	2,5±0,3	0,3±0,026	1,7±0,2 р1=0,000012
RP4, нг/г тк. RP4, ng/g of tissue	0,3±0,032	3,7±0,39	0,1±0,008 р1=0,000000	1,7±0,19 р1=0,000000

Примечание. р¹ – статистически значимые различия по отношению к показателю при самостоятельном варианте роста опухоли.

Note. р¹ – the differences are significant compared with the isolated tumor growth variant.

При этом уровень Тсв. оказался ниже в 1,5 раза (р˂0,05), а уровни ПРЛ и RA не имели значимых отличий.

В перифокальной зоне опухоли при самостоятельном варианте роста LLC уровень Е1 был выше в 9,2 раза, чем при сочетанном, уровень ПРЛ – в 7,8 раза, а показатели Тсв. не имели достоверных отличий. При этом уровень всех рецепторов гормонов при самостоятельном варианте был выше, чем при сочетанном: REα – в 1,9 раза (р˂0,05), REβ – в 1,7 раза (р˂0,05), RA – в 1,5 раза (р˂0,05) и RP4 – в 2,2 раза (р˂0,05).

Обсуждение. Ранее нами было показано, что коморбидная патология может менять характер развития злокачественного процесса в эксперименте [16]. Одним из возможных путей активации роста меланомы B16/F10 и угнетения карциномы Льюиса у самок мышей линии BALB/c Nude при ПМЗО может быть изменение в опухоли и перифокальной зоне гормонального и рецепторного баланса. Торможение роста LLC у самок мышей основной группы сопровождалось снижением уровня ПРЛ в перифокальной зоне карциномы, в то время как увеличение объемов меланомы сопровождалось повышением уровня ПРЛ как в опухоли, так и в перифокальной зоне и непораженной коже. В настоящее время пролактин рассматривается как многофункциональный полипептид, синтезирующийся не только в гипофизе, но и в различных периферических тканях, а также в опухолях и запускающий пути активации пролиферации, ангиогенеза, ответственного за иммунорегуляцию и дифференцировку клеток [17]. ПРЛ влияет на гомеостаз и метаболизм посредством регуляции ключевых ферментов и транспортеров, связанных с резистентностью к инсулину, гипертонией или коронарным синдромом [18]. Исследования на животных также показывают, что уровень пролактина повышается в ответ на различные стрессор-ные воздействия [19].

Учитывая тот факт, что органом-реципиентом меланомы В16/F10 является кожа, особый интерес представляли изменения исследованных в ней показателей при самостоятельном росте опухоли и при ПМЗО. Обращает на себя внимание значительная, более чем в 100 раз, разница в содержании пролактина в коже при самостоятельном росте меланомы и при сочетанном с карциномой Льюиса. При этом резкое повышение уровня ПРЛ в коже при сочетанном процессе сопровождалось падением в ней содержания эстрона, а низкие концентрации пролактина в коже мышей при самостоятельном росте меланомы сопровождались высокими показателями Е1. Ранее нами показано большое значение эстрона в росте меланомы у мышей линии BLc/6, высокий уровень которого определяли в опухоли, перифокальной зоне (по мере роста меланомы) и непораженной коже [13].

Также увеличение объемов меланомы В16/F10 характеризовалось повышением в непораженной коже уровня Тсв., ERβ и RP4, сопровождающимся также высокими концентрациями Тсв. и ПРЛ в опухоли и перифокальной зоне. В то же время уменьшение объемов карциномы Льюиса у самок основной группы сопровождалось снижением концентрации рецепторов стероидных гормонов в опухоли и перифокальной зоне на фоне повышения только в карциноме Льюиса уровня Тсв.

Некоторые иммуногистохимические исследования показали, что в меланоцитарных невусах и злокачественных клетках меланомы присутствуют рецепторы эстрогенов – как REβ, так и REα. Было показано, что подавление REα находится под эпигенетическим контролем и, по-видимому, прямо пропорционально прогрессированию заболевания [20]. Напротив, экспрессия REβ обратно коррелирует с толщиной опухоли по Бреслоу – наиболее важным и независимым прогностическим маркером меланомы [21]. Суперсемейство ядерных рецепторов также включает рецептор андрогенов, состоящий из α- и β-изоформ, кодируемых геном, расположенным на X-хромосоме [22]. RA реагирует на андрогенные гормоны, используя те же геномный и негеномный пути, что и RE, и вызывая аналогичные эффекты [23]. Хотя экспрессия RA является менее изученной, чем экспрессия RE, она была оценена в нескольких клеточных линиях меланомы и в образцах метастазов человека, где были обнаружены высокие уровни рецепторов [24]. Что касается прогестерона, то на сегодняшний день идентифицированы различные рецепторы, которые способны активировать как геномные, так и негеномные пути [22].

В исследовании нами установлено, что при самостоятельном росте меланомы В16/F10 и карциномы Льюиса у самок иммунодефицитных мышей BALB/c Nude перифокальные зоны содержали более высокие концентрации Е1, ПРЛ и рецепторов всех изученных стероидных гормонов по сравнению с соответствующими им тканями опухолей. Это отличалось от ранее полученных нами результатов в эксперименте с мышами линии Black без нарушений в работе иммунной системы, когда у животных с перевивной меланомой В16/F10 именно опухоль содержала максимальные уровни Е1 и рецепторов стероидных гормонов [13]. Предполагается, что эстрон может неблагоприятно воздействовать на организм человека как «эндокринный разрушитель», оказывая пролиферативное действие на клетки рака [25].

Снижение уровня эстрона при ПМЗО может быть обусловлено высоким уровнем метаболизма данного эстрогена, а бурный рост опухоли предполагает метаболизм по направлению образования 16-ОНЕ [26]. В этом случае повышение уровня рецепторов эстрогенов в коже и отсутствие изменения их концентрации в образцах меланомы (в отличие от снижения их уровня в опухолевой ткани карциномы Льюиса в основной группе) может сви- детельствовать о длительной ковалентной связи, стимулирующей пролиферацию клеток [27].

Непораженная кожа при ПМЗО у самок мышей оказалась наиболее метаболически активной тканью, в которой поддерживалось наиболее высокое содержание не только эстрона, тестостерона и пролактина, но и рецепторов стероидных гормонов, что, очевидно, благоприятствовало бурному росту меланомы.

Заключение. В настоящем исследовании показано, что в результате одновременного развития перевитых подкожно меланомы В16/F10 и карциномы Льюиса у самок мышей BALB/c Nudе сокращалась продолжительность жизни на фоне увеличения объемов меланомы и сокращения первичных узлов карциномы. При этом у животных с ПМЗО в образцах опухолей резко снижался уровень эстрона, но повышалось содержание тестостерона. Возможно, существенное увеличение объема меланомы связано с высоким содержанием пролактина и рецепторов половых стероидов в непораженной коже как источнике меланоцитов – клеток, из которых развивается данная опухоль. Малые размеры карциномы Льюиса у самок основной группы сопровождались снижением как в опухоли, так и в ее перифокальной зоне практически всех исследованных рецепторов и гормонов.