Особенности субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у первичных пациентов с нерезектабельным раком лёгкого и их значение для дальнейшей оптимизации химиолучевой терапии

Рак лёгкого (РЛ) остаётся ведущей онкологической проблемой, занимая 1-е место по смертности как в России, так и в мире. Среди всех злокачественных новообразований РЛ находится на 2-м месте по частоте выявления. В 2022 г. в Российской Федерации диагностирован 44981 новый случай, летальность на первом году составляет 44,8%. Ежегодно от РЛ умирает больше пациентов, чем от рака простаты, молочной железы и толстой кишки вместе взятых [1, 2].

Мушкарина Т.Ю.* – науч. сотр.; Гривцова Л.Ю. – зав. отд., д.б.н.; Глухарева А.Е. – врач-онколог; Мельникова А.А. – биолог; Афонин Г.В. – зав. отд., к.м.н.; Иванов С.А. – директор, чл.-корр. РАН, д.м.н., проф. кафедры РУДН. МРНЦ им. А.Ф. Цыба – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России. Каприн А.Д. – ген. директор, директор МНИОИ им. П.А. Герцена, зав. каф. РУДН, акад. РАН, д.м.н., проф. ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России.

Несмотря на рост выявляемости локализованных стадий (+3,9% в год в 2013-2017 гг.), около 70% пациентов на момент установки диагноза имеют III-IV стадию [2-4].

Немелкоклеточный рак лёгкого (НМРЛ) составляет более 80% всех случаев РЛ, с преобладанием аденокарциномы и плоскоклеточного рака как основных подтипов [5].

Стратегии лечения РЛ активно совершенствуются. Для пациентов с нерезектабельным НМРЛ III стадии химиолучевая терапия остаётся стандартным подходом к лечению [6]. Таргетная терапия в отдельных когортах пациентов (наличие мутаций EGFR, ALK, ROS1 и NTRK) и иммунотерапия ингибиторами контрольных иммунных точек приводит к улучшению онкологических результатов [7, 8]. Однако показания к данному виду терапии имеют всего лишь 15-20% пациентов, а эффективность таргетной терапии часто ограничивается развитием резистентности опухоли к лечению [9].

В последние годы много внимания уделяется такому важному показателю, как микроокружение опухоли, поскольку перспективными для улучшения результатов терапии считаются точечные методы воздействия на отдельные его компоненты. Вместе с тем следует учитывать, что иммунная система не является локальной: иммунокомпетентные клетки активно рециркулируют по организму, обеспечивая иммунный гомеостаз – равновесие врождённых и адаптивных компонентов, контролирующих постоянство внутренней среды и распознающих «своё» и «чужое». Ключевую роль в поддержании этого равновесия играют регуляторные Т-клетки (Treg), которые в физиологических условиях супрессируют аутореактивные клоны, предотвращая аутоиммунные реакции. Однако в условиях злокачественного роста их активность приобретает проопухолевую направленность, что проявляется в подавлении локального противоопухолевого иммунного ответа. Очевидно, что у онкологического пациента регуляция иммунной системы закономерно нарушается как вследствие самого опухолевого процесса, так и под действием проводимой лекарственной терапии, что позволяет рассматривать любого такого пациента как носителя вторичного иммунодефицита, хотя данное положение нуждается в фактическом подтверждении.

Таким образом, целью настоящего исследования явилась оценка популяционного состава иммунных клеток (лимфоцитов) периферической крови у первичных пациентов с НМРЛ. Выявление возможных отклонений в популяционном составе лимфоцитов позволит подтвердить наличие вторичного иммунодефицита, определить показания к иммунотерапевтической коррекции у данной категории больных, а также идентифицировать новые прогностически значимые маркеры, имеющие важное значение для дальнейшей оптимизации химиолучевой терапии.

Материалы и методы

В исследование включён анализ образцов периферической крови 90 пациентов с диагнозом местнораспространённый нерезектабельный НМРЛ (IIIB-IIIC стадии) на этапе первичной диагностики и стадирования заболевания, а также образцы крови 40 условно здоровых доноров (группа контроля).

В исследуемой группе доля мужчин составила 86% (n=77), в контрольной – 45% (n=18). Средний возраст обследованных в этих группах равнялся 60,0 ± 12,0 лет и 39,0 ± 10,0 лет соответственно. Гистологически у пациентов основной группы преобладал плоскоклеточный рак (66%, 59 из 90 человек), у 30 пациентов из 90 (33%) выявлена аденокарцинома и у 1 пациента – плеоморфный тип опухоли (1%).

Субпопуляционный состав лимфоцитов изучали в прямой реакции иммунофлуоресценции (РИФ) с применением моноклональных антител к основным антигенам лимфоцитов человека, конъюгированных с различными флуорохромами (CD3-FITC; CD127-FITC; CD8-PE; CD19-PE; CD4-PerCP; CD25-PE-Cy7; CD56-PE-Cy7; CD45-APC-H7). Результаты РИФ оценивали методом проточной цитометрии на 6-цветном приборе BD FACS Canto™ II (BD Biosciences, США). Абсолютное содержание клеток определяли двухплатформенным методом по данным общего числа лимфоцитов, измеренных на анализаторе UniCel DxH 800 (Beckman Coulter, США). Данные проточной цитометрии обрабатывали с применением программного обеспечения Kaluza Analysis (Beckman Coulter, США) и FACSDiva Software 6.0 (BD Biosciences, США).

Статистическая обработка данных проведена с применением программы STATISTICA 8.0 (StatSoft). Результаты статистической обработки данных по исследуемым количественным признакам представляли в виде среднего (М) и стандартного отклонения (σ). Для определения межгрупповых различий использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни и параметрический t-критерий Стьюдента. Различия величин считали значимыми при p<0,05.

Результаты

При сравнении показателей пациентов с местнораспространённым нерезектабельным НМРЛ и условно здоровых доноров установлен ряд статистически значимых отличий. Состав периферической крови пациентов характеризовался значимо более высокими показателями лейкоцитов (9,1 ± 4,4 x 10 3 кл/мкл против 5,7 ± 1,4 x 10 3 кл/мкл, р<0,0001), в то время как относительное количество лимфоцитов у пациентов было достоверно более низким (21,9 ± 9,8% против 30,9 ± 6,3%, р<0,0001). При этом абсолютное количество лимфоцитов в сравниваемых группах значимо не отличалось вследствие большего числа лейкоцитов крови у пациентов исследуемой группы.

При оценке субпопуляционного состава лимфоцитов в исследуемой группе в сравнении с группой контроля отмечено значимое снижение относительного количества CD3⁺Т-лимфоцитов (70,9 ± 10,7% против 77,7 ± 7,6%, р=0,0004) и CD4⁺Т-клеток (42,6 ± 13,6% против 48,7 ± 8,2%, р=0,006). Различия в абсолютных показателях оказались незначимыми, р>0,05. Выявлено статистически значимое повышение как относительного, так и абсолютного содержания двойных позитивных CD4⁺CD8⁺Т-клеток (1,3 ± 0,3% против 0,5 ± 0,2% и 21 ± 3 кл/мкл против 10 ± 2 кл/мкл соответственно, р=0,001).

Также обнаружено значимое повышение относительной доли CD3^-CD56⁺NK-клеток (13,8 ± 10,7% против 9,9 ± 5,8%, р=0,025) и их абсолютного количества (399 ± 286 кл/мкл против 252 ± 139 кл/мкл, р=0,03). Дополнительно в группе пациентов относительно доноров получено значительное увеличение уровня популяции CD3⁺CD56⁺NKT-клеток как по относительному, так и по абсолютному показателю (р<0,05). Процент этих клеток в крови пациентов составил 8,3 ± 1,3%, а их абсолютное количество - 160 ± 25 кл/мкл, в то время у доноров эти показатели равнялись 2,5 ± 1,8% и 28 ± 6,2 кл/мкл соответственно.

В отношении CD19⁺В-лимфоцитов при впервые выявленном местнораспространённом нерезектабельном НМРЛ установлено значимое снижение их относительного содержания в сравнении с контрольными значениями (9,0 ± 6,0% против 13,0 ± 4,0%, р=0,04) и абсолютного количества (166 ± 134 кл/мкл против 289 ± 57 кл/мкл, р=0,001).

При анализе уровня циркулирующих Treg-клеток отмечены выраженные различия между основной (n=10) и контрольной группами (р<0,05). У пациентов наблюдалось значимое увеличение процента Treg-клеток (9,9 ± 3,2% против 3,7 ± 1,9% в контроле) и их абсолютного количества (100 ± 46 кл/мкл против 31 ± 17 кл/мкл соответственно) (рис. 1).

А                             Б

Рис. 1. Относительное (А) и абсолютное (Б) количество Тreg-клеток пациентов с впервые выявленным местнораспространённым нерезектабельным НМРЛ в сравнении с условно здоровыми донорами (группа контроля).

При оценке баланса эффекторных и регуляторных субпопуляций лимфоцитов выявлено статистически значимое снижение соотношения CD8+T-клеток/Treg-клеток в группе пациентов с впервые выявленным местнораспространённым нерезектабельным НМРЛ относительно кон- троля (2,0±1,6 против 9,6±6,3, р=0,0002) (рис. 2).

• □ Контроль аНМРЛ

Рис. 2. Соотношение CD8⁺T-клеток/Тreg-клеток пациентов с впервые выявленным местнораспространённым нерезектабельным НМРЛ в сравнении с условно здоровыми донорами (группа контроля).

Обсуждение результатов

Исходное состояние иммунной системы онкологического пациента, способность эффекторных иммунных клеток к активации, соотношение эффекторных и регуляторных популяций играет немаловажную роль в эффективности проводимой специфической терапии. Изменение состава иммунокомпетентных клеток крови может служить биомаркером прогноза ответа на терапию [10].

В данном исследовании мы проанализировали состав популяций лимфоцитов клеток периферической крови у нелеченых пациентов с диагнозом нерезектабельный НМРЛ, подлежащих в дальнейшем сочетанной химиолучевой терапии.

Исследование показало, что у пациентов с нерезектабельным НМРЛ по сравнению с группой условно здоровых доноров наблюдаются разнонаправленные изменения субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови. В частности, установлено снижение процентного количества CD4+Т-клеток. Эти клетки обеспечивают формирование иммунологического синапса при взаимодействии с антигенпрезентирующими клетками и способствуют выработке В-клетками специфических антител. Уменьшение их содержания может быть напрямую связано со снижением реакции иммунной системы на патоген, в том числе на опухолевую клетку [11-13]. Химиолучевая терапия, являясь дополнительным фактором иммуносупрессии, способствует дальнейшему снижению уровня CD4+Т-клеток, что обусловливает необходимость разработки и внедрения подходов к иммунокоррекции, направленных на восстановление их процентной доли в терапии данной категории пациентов [14].

Особый интерес представляют двойные позитивные CD4⁺CD8⁺Т-клетки, которые более свойственны тимическому этапу развития Т-клеток. Вместе с тем зрелые CD4⁺CD8⁺Т-клетки обнаруживаются в периферической крови и в периферических лимфоидных органах. Данная популяция не является однородной, а их функциональная роль (цитотоксическая или супрессорная) до сих пор окончательно не прояснена [15]. Показано, что частота двойных позитивных CD4⁺CD8⁺Т-клеток в периферической крови у пожилых людей выше, чем у молодых, и эти клетки могут модулировать иммунный ответ, секретируя интерлейкин-10 (IL-10), интерферон-гамма (IFN- γ ) и трансформирующий фактор роста бета (TGF- β ). В случае злокачественных новообразований установлено, что CD4⁺CD8⁺Т-клетки обнаруживаются в большем количестве при нодулярной лимфоцитарно-преобладающей лимфоме Ходжкина, меланоме, гепатоцеллюлярной карциноме и раке молочной железы. Более высокая представленность двойных позитивных CD4⁺CD8⁺Т-клеток при распространённых стадиях рака в сочетании с их возможной цитотоксической активностью и характерным цитокиновым профилем позволяет предположить, что эти клетки могут играть решающую роль в модулировании иммунных реакций при злокачественных новообразованиях [16]. В настоящем исследовании у пациентов с местнораспространённым НМРЛ в дебюте заболевания выявлено повышение уровня CD4⁺CD8⁺Т-клеток в периферической крови по сравнению с донорами, что, предположительно, может быть связано с хроническим воспалением. Полученные данные обосновывают целесообразность дальнейшего изучения динамики уровня данных клеток в процессе противоопухолевого лечения, поскольку сведения об изменении данной субпопуляции на фоне химиолучевой терапии в доступной литературе отсутствуют, что может способствовать разработке дополнительных критериев для мониторинга эффективности терапии и прогнозирования течения заболевания.

CD3-CD56+NK- и CD3+CD56+NKT-клетки являются важными популяциями врождённого иммунитета, участвующими в противоопухолевом ответе. В экспериментальной модели рака молочной железы E0771 показано, что эти клетки имеют различное тканевое распределение, но претерпевают сходные изменения в микроокружении опухоли на фоне прогрессирования заболевания. На поздних стадиях CD3-CD56+NK-клетки проявляют признаки старения и дисфункции, тогда как CD3+CD56+NKT-клетки (за исключением инвариантных субтипов) демонстрируют истощение [17]. Имеются данные о клинической значимости уровня NK-клеток в дебюте НМРЛ. Благоприятные исходы иммунотерапии ассоциированы с высоким содержанием фенотипически активных CD3-CD56+NK-клеток, а также с сочетанием повышенного числа циркулирующих

CD3-CD56+NK- и PD-1+CD8+Т-клеток и низкого соотношения PD-1/CD8 среди опухоль-инфильтри-рующих лимфоцитов, что коррелирует с более длительной выживаемостью без прогрессирования [18]. В экспериментальной модели E0771 на ранних стадиях (10-й день) в периферической крови мышей выявлено увеличение абсолютного количества NK-клеток, которое снижалось по мере прогрессирования опухоли [17]. В данном исследовании у пациентов отмечено повышение уровня суммарного пула CD3+CD56+NKT-клеток и CD3-CD56+NK-клеток по сравнению с донорами, что согласуется с данными российских и зарубежных работ при раке яичников, молочной железы и эпителиальных новообразованиях [19-21]. Таким образом, повышенные уровни NK- и NKT-клеток в дебюте заболевания расширяют представления об исходном иммунном статусе пациентов с НМРЛ и, учитывая их ключевую роль в противоопухолевом иммунитете, указывают на необходимость изучения их функциональной активности и прогностической значимости на фоне химиолучевой терапии как в самостоятельном виде, так и в комбинации с иммунотерапией.

Не менее важную роль в реализации противоопухолевого ответа играют зрелые В-клетки – ключевой компонент адаптивного иммунитета. Данные клетки секретируют патоген-нейтрали-зующие антитела и провоспалительные цитокины, а также могут дифференцироваться в В-клетки памяти, обеспечивающие длительную защиту. Кроме того, В-клетки функционируют как альтернативные антигенпрезентирующие клетки [22, 23]. В настоящей работе установлено снижение суммарного количества В-клеток в периферической крови пациентов с местнораспространённым НМРЛ, что может свидетельствовать о недостаточности гуморального иммунного ответа.

В данной работе обнаружено значимое увеличение количества циркулирующих Treg-клеток и снижение соотношения CD8+/Treg у пациентов с НМРЛ по сравнению с контролем, что согласуется с данными о ключевой роли Treg-клеток в иммуносупрессии при злокачественных новообразованиях [24]. Повышенный уровень Treg-клеток ассоциирован с неблагоприятным прогнозом и сокращением выживаемости при НМРЛ [25]. Выявленный дисбаланс в сторону регуляторных популяций может отражать исходную иммуносупрессию у данной категории пациентов и обосновывает дальнейшее изучение Treg-опосредованных механизмов как в качестве прогностических маркеров, так и в качестве потенциальных терапевтических мишеней, что открывает перспективы для иммунотерапевтической коррекции, направленной на элиминацию этих клеток [10].

Заключение

Таким образом, у онкологических пациентов с НМРЛ присутствуют количественные и качественные изменения на уровне отдельных популяций иммунокомпетентных клеток периферической крови. Выявленные разнонаправленные изменения среди иммунных клеток крови у пациентов с местнораспространённым НМРЛ (IIIB-IIIC стадии) подтверждают наличие вторичного иммунодефицита у данной категории больных. Клиническая значимость выявленных нарушений требует дальнейшего изучения, однако уже на текущем этапе очевидна необходимость оценки иммунологических показателей крови у первичных пациентов с НМРЛ, как возможных биомаркеров. Эффективность химиолучевой терапии может зависеть от состояния иммунной системы пациента, а её проведение способно усиливать имеющиеся иммунные дисбалансы. Полученные данные об исходных изменениях субпопуляционного состава лимфоцитов в дальнейшем послужат основой для стратификации пациентов по риску развития иммуносупрессии, выбора оптимального режима лечения, химиолучевой терапии в частности, и разработки сопутствующей иммуно-коррегирующей поддержки.