Особенности субпопуляционного состава лимфоцитов у онкологических больных при комбинированном лечении с включением адаптивной иммунотерапии

В настоящее время злокачественные новообразования толстой кишки и меланома вышли на лидирующие позиции по заболеваемости во всем мире, в том числе и в Российской Федерации [7]. Достоверно показано, что иммунная система способна распознавать злокачественные клетки и реагировать на такое распознавание активацией и последующими каскадами иммунных реакций [1]. Одним из последствий активации сигнальных каскадов в лимфоцитах является выработка цитокинов и проявление цитотоксических свойств, направленных на элиминацию трансформирован- ных клеток [5]. Особое внимание стоит уделить NK-клеткам (natural killer cells), которые обладают противоопухолевой цитотоксической активностью и способны без предварительной иммунизации лизировать чужеродные и собственные измененные клетки [2, 15]. При различных онкологических заболеваниях сниженное количество и активность NK-клеток могут служить прогностическим критерием метастазирования, плохого ответа на лечение и уменьшения показателей общей выживаемости [13]. Резкое увеличение количества NK-клеток и повышение их функциональной активности обычно связывают с лимфопролиферативным синдромом или вирусными гепатитами [2]. Также к цитолизу злокачественных клеток способны цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) и NKT-клетки (natural killer Т-cells). Однако негативное воздействие на противоопухолевый иммунный ответ могут оказывать регуляторные Т-клетки (Тreg) с фенотипом CD4+CD25bright, которые подавляют его, тем самым способствуя опухолевой прогрессии [6]. В практике лабораторий, осуществляющих фенотипирование лимфоцитов, наиболее широко проводится оценка субпопуляций CD4+ и CD8+Т-клеток, иногда определяют экспрессию молекул HLA-DR на Т-клетках [10, 11]. Очевидно, что этих показателей недостаточно для комплексной оценки противоопухолевого звена клеточного иммунитета.

При определении функциональной активности лимфоцитов, особенно при воздействии иммуно-тропных лекарственных средств (химиотерапия, иммунотерапия), целесообразно оценивать экспрессию поверхностных маркеров активации как на всех лимфоцитах, так и на отдельных субпопуляциях. Для этой цели можно изучать маркеры ранней (CD38, СD69) и более поздней (CD25, HLA-DR) активации лимфоцитов [8]. Молекула CD38 – мембранный гликопротеин, экспрессируется на активированных Т-, В-, NK-клетках, модулирует межклеточные взаимодействия и является переносчиком трансмембранных сигналов. Клетки с высоким уровнем экспрессии CD38 проявляют низкую пролиферативную активность, но обладают высоким потенциалом в отношении продукции интерлейкина-2 (IL-2) и интерферона-гамма (IFN-γ) [16]. Молекула CD38 представлена также на поверхности клеток в период их пролиферации и дифференцировки. Рецептор CD69 не экспрессируется на покоящихся лимфоцитах периферической крови, но появляется после активации лимфоцитов в течение 1–2 часов после антигенной стимуляции, имеет прямое отношение к активации генов, ответственных за синтез IL-2. Выявлено, что Т-клетки с высокой экспрессией молекулы CD69 способствуют опухолевой прогрессии [8]. Сигналы, поступающие с рецептора активированных СD69+лимфоцитов, вызывают увеличение продукции IL-2 и экспрессию рецепторов к нему на иммунокомпетентных CD25+клетках [12]. Молекула CD25 представляет собой α-цепь рецептора IL-2, которая появляется только при активации клетки. CD25 экспрессируют различные типы клеток периферической крови: CD4+, CD8+, NK-, NKT-, В-клетки и моноциты. CD25+лимфоциты в норме могут составлять до 18 % от общей популяции лимфоцитов [10, 11]. Повышение экспрессии молекул HLA-DR на клеточной мембране является одним из маркеров поздней и длительной активации клеток [8]. Это происходит в ответ на выработку цитокинов активированными иммунокомпетентными клетками [14]. Одним из поверхностных маркеров активированных NK-клеток является трансмембранный гликопротеин или естественный рецептор цитотоксичности NKG2D (CD314), который принадлежит к лектиноподобным рецепторам и необходим для проведения сигнала внутрь клетки, а также повышения функциональной активности киллеров [2]. Помимо NK-клеток, рецептор NKG2D определяется на некоторых γδТ-лимфоцитах и является костимулирующей молекулой для CD8-позитивных Т-лимфоцитов. Однако на сегодняшний день неизвестны точные механизмы активации и супрессии противоопухолевого иммунного ответа. Поэтому изучение закономерностей функционирования субпопуляций лимфоцитов, механизмов их активации и фенотипических маркеров позволит дополнить наше представление о роли иммунной системы в канцерогенезе. Таким образом, для наиболее полной характеристики клеточного звена противоопухолевого иммунитета необходимо определять не только субпопуляции эффекторных и супрессорных лимфоцитов, но также оценивать их активационную способность по поверхностной экспрессии соответствующих CD-маркеров.

Целью исследования явилось изучение реакции иммунной системы больных раком толстой кишки и меланомой на комбинированное лечение.

Материал и методы

В исследование включены 82 пациента с гистологически подтвержденным диагнозом, подписавшие информированное согласие. Всем больным проводилось хирургическое лечение с лучевой и/ или химиотерапией на базе МРНЦ им. А.Ф. Цыба. В первую группу были включены 47 пациентов с диссеминированным раком толстой кишки (РТК) T2–3N1–2M0–1 стадии, в возрасте 40–57 лет. Во вторую группу вошли 35 больных метастатической меланомой кожи IIIC(N3) – IV стадии, в возрасте – 31–85 лет. В качестве группы сравнения исполь- зовали результаты фенотипирования лимфоцитов практически здоровых людей [10].

На этапах лечения перед проведением курса химиотерапии производили забор крови из локтевой вены. Периферические мононуклеары выделяли по стандартной методике на градиенте плотности и культивировали в концентрации 1–2×106 кл/мл на протяжении 7–8 дней в полной питательной среде X-Vivo20 (Lonza, США) c 250 ед/мл IL-2 (ронколейкин, Биотех, Россия) и 50 нг/мл IL-15 (ImmunoTools, Германия) в СО2-инкубаторе при 37°С. На 3, 5 и 7-й день культивирования собирали необходимое количество клеток для иммунотерапии. На фоне химиотерапии проводили адоптивную иммунотерапию активированными лимфоцитами 12 больным РТК и 28 пациентам с меланомой. Субпопуляционный состав лимфоцитов и маркеры активации оценивали у всех больных до лечения и через 1 мес после адоптивной иммунотерапии в сочетании с химиотерапией. Анализ иммунологических показателей проводили в сравнении с клинической оценкой эффективности лечения (стабилизация, прогрессирование, регрессия) у 28 больных меланомой.

Для фенотипирования лимфоцитов использовали гепаринизированную периферическую кровь больных данных групп и флуоресцентно меченные антитела к CD3, CD4, CD8, CD16, CD20, CD25, HLA-DR, CD38, CD56, CD69, CD95 (Beckman Coulter, Франция) и CD314 (eBioScience, США). В работе оценивали фенотип В-, Т-, NKT-, NK-лимфоцитов периферической крови и маркеры активации (HLA-DR, CD38, CD69, CD314, CD25). Для выделения области лимфоцитов использовали антитела к СD45. Иммунофлуоресцентное окрашивание проводили в фосфатном буферном солевом растворе с pH7,2 (PBS), содержащем 1 % эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и 0,02 % NaN3, в течение 30 мин при 4°С, с последующей двукратной отмывкой PBS путем центрифугирования. Цитометрические измерения проводили на проточном цитофлуориметре FACScan (Becton Dickinson, США). Анализировали не менее 10 000 событий в секторе живых клеток в экспериментах по анализу экспрессии поверхностных маркеров. Обработку полученных результатов проводили с помощью программы CellQuest.

Статистический анализ данных проводили с помощью программ Microsoft Excel 2003 и Statsoft

Statistica 6.0. Данные представляли как среднее по группе. Для сравнения показателей фенотипа лимфоцитов двух групп пациентов использовали t-критерий Стьюдента. Различия считали значимыми при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Субпопуляционный состав лимфоцитов и экспрессия маркеров активации были оценены до начала и через 1 мес после комбинированного лечения у 47 пациентов с диссеминированным раком толстой кишки и у 35 больных с метастатической меланомой кожи. У больных меланомой отмечено повышение абсолютного содержания Тreg-клеток (CD4+25bright) в 50 % случаев, всех активированных HLA-DR+лимфоцитов – в 33 % и экспрессии α-цепи рецептора IL-2 (CD25) – в 42 % наблюдений, что подтверждает данные, ранее полученные нами на меньшем количестве больных [3, 4, 9]. Относительное содержание основных субпопуляций В-, Т- и NK-лимфоцитов находилось в пределах референсных значений. Однако отмечалось некоторое снижение абсолютного уровня В-лимфоцитов. У больных меланомой экспрессия активирующего рецептора NKG2D (CD314) на всех лимфоцитах составила 42,3 %, а на NK-клетках – 12,64 % (таблица). Таким образом, в среднем 82 % NK-клеток несут на поверхности рецептор NKG2D, 37 % – антиген CD69. Экспрессия специализированного рецептора CD95, запускающего апоптоз, выявлена на 43,65 % Т-лимфоцитов у больных меланомой и на 36,2 % Т-лимфоцитов у больных РТК, что свидетельствует об активации большинства лимфоцитов и возможном окончании процесса их дифференцировки, а также о повышенной чувствительности данных лимфоцитов к FasL-индуцированному апоптозу [8]. На основе полученных данных можно сделать вывод о том, что для большей части больных с метастатической меланомой характерно повышенное содержание Тreg, CD25+лимфоцитов и HLA-DR+Т-лимфоцитов.

В периферической крови больных РТК до иммунотерапии отмечалось снижение относительного числа В-лимфоцитов в 31 % случаев. У 56 % больных наблюдалось повышение абсолютного и у 81 % – относительного содержания Тreg-клеток (CD4+CD25bright). Возможно, что эти изменения связаны с увеличением иммуносупрессивного воздействия Тreg-клеток у больных с диссеми-

Таблица

Фенотипическая картина лимфоцитов и маркеров активации в сравниваемых группах больных