Особенности субпопуляционного состава т-хелперов периферической крови в отдалённые сроки у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию in utero

Т-хелперы играют важную роль в регуляции иммунной системы: от активации В-лимфоци-тов, цитотоксических Т-лимфоцитов и других популяций клеток до подавления иммунного ответа. Популяция Т-хелперов является гетерогенной, клетки из разных субпопуляций отличаются профилем экспрессии транскрипционных факторов, секрецией цитокинов, поверхностными хемоки-новыми рецепторами [1]. При этом Т-хелперы обладают пластичностью, способны переключаться с одной линии на другую, могут иметь смешанный фенотип, что сопровождается изменением паттерна секреции цитокинов и экспрессией хемокиновых рецепторов [2]. Весь спектр клеток Т-звена позволяет обеспечивать эффективный контроль иммунного ответа и выполнение специфических функций, в том числе принимать участие в противоопухолевой защите организма [3].

Результаты научных исследований свидетельствуют о том, что воздействие ионизирующего излучения вызывает долгосрочные изменения Т-клеточного звена иммунитета [4, 5]. Так,

например, у жителей прибрежных сёл реки Течи, проживавших на загрязнённой территории, отмечались признаки иммунного дисбаланса через 40-45 лет после начала облучения [6, 7].

Изменение в генной экспрессии представляет собой ключевой компонент биологического ответа клетки на радиационное воздействие. В настоящее время показано, что ионизирующее излучение способно оказывать влияние на профиль экспрессии факторов транскрипции (T-bet, GATA3, FOXP3 и др.), участвующих в запуске каскада сигнальных путей, контролирующих дифференцировку и пролиферацию Т-клеток, секрецию цитокинов, а также изменение репертуара Т-клеточного рецептора [8]. Важно отметить, что подавляющее большинство экспериментальных работ нацелены на описание паттерна экспрессии генов в течение короткого промежутка времени после острого однократного облучения, затрудняя экстраполяцию данных при описании отдалённых эффектов облучения у человека. В связи с чем вопрос о биологическом ответе на длительное, хроническое радиационное воздействие, особенно полученное в разные периоды онтогенеза, остаётся малоизученным.

Цель работы – исследование количества различных субпопуляций Т-хелперов в периферической крови, а также экспрессии генов TBX21, RORC, GATA3, NFKB1, MAPK8 и STAT3, ответственных за регуляцию дифференцировки Т-хелперов, у лиц, подвергшихся хроническому внутриутробному облучению.

Материалы и методы

Предмет и объект исследования. В результате нарушения регламента хранения отработанного ядерного топлива с высоким содержанием делящихся материалов на протяжении нескольких лет ПО «Маяк» осуществляло сбросы жидких радиоактивных отходов (ЖРО) в реку Течу. Так, за период 1949-1956 гг. было сброшено порядка 1,15 x 10 17 Бк ЖРО, включающих ⁹⁰Sr, ⁸⁹Sr, ¹³⁷Cs, ⁹⁵Zr, ⁹⁵Nb, ¹⁴⁴Ce, ¹⁰⁴Ru, что послужило причиной пролонгированного внешнего и хронического внутреннего облучения более 30 тыс. человек, проживающих на прибрежных территориях реки Течи [9]. Накопленные дозы облучения у людей были преимущественно сформированы за период 1951-1960 гг., при этом максимальные значения мощности дозы облучения красного костного мозга (ККМ) были зафиксированы в период с 1951 по 1956 гг. и достигали 1480 мГр/год [10].

В 2011 г. в ФГБУН УНПЦ РМ ФМБА России был создан реестр людей, которые подверглись внутриутробному облучению. Данные люди были рождены со 2 января 1950 г. по 30 сентября 1961 г., в связи с чем ионизирующее излучение влияло на них как внутриутробно, так и после рождения. Внутреннее облучение определял ¹³⁷Cs, который попадал в организм беременной женщины через продукты питания местного производства и воду. Неравномерное облучение ККМ формировалось из-за поступления радионуклидов ⁸⁹Sr и ⁹⁰Sr в кости плода. Средняя доза внутриутробного облучения ККМ составила 30 мГр, причём около 90% из этой дозы было внесено P -излучением. Максимальное значение дозы на ККМ, полученной человеком во время внутриутробного периода в этой когорте, достигало значения в 1050 мГр [9].

Исследование субпопуляционного состава Т-хелперов и транскрипционной активности генов было проведено в отдалённые сроки (спустя более 60-70 лет) после начала хронического облучения у 156 человек. Участники исследования подписывали добровольное информированное согласие, одобренное этическим комитетом УНПЦ РМ ФМБА России, в соответствии с Хельсинкской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (2013 г.), действующим законодательством Российской Федерации и нормами медицинской этики.

В работе было обследовано три группы лиц:

• 1.    Основная группа включала 40 человек, подвергшихся хроническому радиационному воздействию в период внутриутробного и постнатального развития (группа облучённых in utero ).

• 2.    Группу сравнения составили 71 человек, которые проживали в прибрежных сёлах реки Течи, но дозы облучения ККМ у них не превышали 70 мГр за весь период жизни. Данная группа была сопоставима по полу, этнической принадлежности и возрасту с основной группой.

• 3.    Вторую группу сравнения составили 44 человека, подвергшихся хроническому радиационному облучению только в постнатальный период. Обследуемые группы хронически облучённых лиц имели сопоставимые по величине накопленные поглощённые постнатальные дозы облучения ККМ (группа сравнения 2).

Основные характеристики исследуемых групп представлены в табл. 1.

Характеристика исследуемых групп

Таблица 1

Характеристика групп	Облучённые in utero N=40	Группа сравнения 1 N=71	Группа сравнения 2 N=44
Возраст на момент прохождения обследования M±SE (min-max)	70,38±0,27 (67-73)	70,25±0,65 (63-83)	76,29±0,56 (71-84)
Пол, N, %                         Мужчины Женщины	17 (42,5) 23 (57,5)	21 (29,6) 50 (70,4)	15 (34,1) 29 (65,9)
Этническая принадлежность, N, %    Славяне Татары и башкиры	12 (30) 28 (70)	28 (39,4) 43 (60,6)	19 (43,2) 25 (51,8)
Накопленная постнатальная доза облучения ККМ, мГр: M±SE (min-max)	496±51,2 (73,5-1298)	18,7±1,97 (0,78-57)	571±49,1 (86,74-1240)
Накопленная постнатальная доза облучения тимуса и периферических лимфоидных органов, мГр: M±SE (min-max)	63,7±8,03 (4,63-204)	7,34±1,07 (0,21-39,5)	95,2±11,1 (10-355)
Накопленная доза облучения ККМ в период внутриутробного развития, мГр: M±SE (min-max)	95,2±15,3 (0,0009-264)	7,4±2,17 (0-42,7)	0
Накопленная доза облучения тимуса и периферических лимфоидных органов в период внутриутробного развития, мГр: M±SE (min-max)	6,20±1,45 (0,0002-46,04)	2,56±1,10 (0,01-26,13)	0

При формировании групп были использованы следующие критерии включения в исследование: 1) облучённые лица из когорты реки Течи, проживавшие в одном из 41 села, расположенного на побережье реки Течи, в период с 01.01.1950 по 31.12.1960 гг.; 2) наличие рассчитанной индивидуальной поглощённой накопленной дозы облучения ККМ, полученной в антенатальный и постнатальный периоды развития.

Индивидуальные дозы, полученные членами когорты в период внутриутробного развития, а также ежегодные постнатальные дозы были оценены на основе дозиметрической системы реки Течи (TRDS-2016D) [10], в которую был включён специальный алгоритм для расчёта доз внутриутробного облучения.

Дозы, полученные в период внутриутробного развития, воздействовавшие на ККМ, были рассчитаны как сумма внутренних доз, накопленных в результате перехода радионуклидов из организма матери в организм плода, и внешних доз, накопленных в период пребывания матери на загрязнённой территории (около дома или вблизи реки). Для расчёта внутренних доз от 89,90Sr использовалась биокинетическая модель перехода стронция из организма матери в плод и новая дозиметрическая модель беременной женщины [11, 12].

Критерии исключения: 1) наличие у обследованных лиц онкологических, аутоиммунных, острых или хронических (период обострения) воспалительных заболеваний на период обследования;

• 2) диагностическое медицинское облучение и приём противоопухолевых препаратов, антибиотиков, стероидных гормонов из подкласса кортикостероидов в течение последних 6 мес. до исследования; 3) наличие контакта с генотоксичными агентами в процессе профессиональной деятельности.

Оценка субпопуляций Т-хелперов. Схема исследования субпопуляционного состава Т-хелперов периферической крови облучённых лиц методом проточной цитометрии подробно описана в статьях [13, 14]. Были исследованы следующие популяции клеток (в скобках представлены фенотипы): Т-хелперы (CD3+CD4+), наивные Т-хелперы (T Naive ) (CD3+CD4+CD45RA+CD62L-), Т-хелперы центральной памяти (T CM ) (CD3+CD4+CD45RA-CD62L+), Т-хелперы эффекторной памяти (T EM ) (CD3+CD4+CD45RA-CD62L-). В популяциях T CM и T EM выделялись следующие субпопуляции: Т-хелперы 1 (Th1) (CXCR5–CXCR3+CCR6-CCR4-), Т-хелперы 2 (Th2) (CXCR5-CXCR3-CCR6-CCR4+) и Т-хелперы 17 (Th17) (CXCR5-CXCR3-CCR6+CCR4-).

Количественная оценка экспрессии генов. Этапы пробоподготовки: экстракция РНК, оценка качественных и количественных выделенных образцов, реакция обратной транскрипции подробно описаны в работе [15].

Количественную оценку экспрессии анализируемых генов проводили по методу 2-ΔΔСt [16]. Данные оценивали относительно уровней мРНК генов «домашнего хозяйства» (housekeeping genes) ACTB и B2M. Анализ кривых амплификации производили в программе Bio-Rad CFX Manager 2.1 (Bio-Rar Laboratories, США) методом пороговой линии. Расчёт проводился с учётом трёх повторов для каждого гена. В работе были использованы коммерческие наборы прайме-ров/зондов, характеристика которых детально представлена в работе [15].

Статистическая обработка результатов. Статистический анализ данных исследования проводили с применением стандартных методов математико-статистической обработки с использованием пакетов программ прикладного статистического анализа (Statistica v. 10.0 и SigmaPlоt v. 12.5). Для оценки межгрупповых различий значений признаков применяли U-критерий Манна-Уитни. Определение вида зависимости исследуемых показателей проводилось с использованием корреляционного анализа по Спирмену. Для всех критериев и тестов различия признавали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты и обсуждение

На рис. 1 представлены результаты исследования Т-хелперов на разной стадии дифференцировки у облучённых лиц.

Было выявлено статистически значимое снижение абсолютного количества T EM в группе лиц, облучённых in utero (M ± SE: 0,23 ± 0,03 10⁹/л), относительно группы сравнения 1 (M ± SE: 0,29 ± 0,02 10⁹/л); p=0,01. Для других показателей значимых различий не наблюдалось (рис. 1А).

Для показателей относительного количества Т-хелперов были выявлены следующие межгрупповые различия относительно группы сравнения 1: снижение общего количества Т-хелперов (для облучённых in utero – M ± SE: 36,98 ± 1,33%; для группы сравнения 1 – M ± SE: 41,88 ± 1,30%; p=0,02), Tem (для облучённых in utero – M ± SE: 25,56 ± 1,94%; для группы сравнения 1 – M ± SE: 29,62 ± 1,23%; p=0,04) и Tcm (для облучённых in utero – M ± SE: 34,40 ± 1,54%; для группы сравнения 1 – M ± SE: 38,24 ± 1,19%; p=0,05) (рис. 1Б). Также относительное количество Tn aive у облучённых in utero статистически значимо выше (M ± SE: 35,05 ± 2,42%), чем у лиц из группы сравнения 1 (M ± SE: 28,32 ± 1,69%; p=0,02). Значимых различий показателей между лицами, облучёнными внутриутробно и постнатально, и группой сравнения 2 обнаружено не было.

Рис. 1. Количество Т-хелперов на разной стадии дифференцировки в периферической крови облучённых лиц: А – абсолютное количество (среднее±ошибка среднего); Б – относительное количество (среднее±ошибка среднего).

Далее проводился корреляционный анализ связи показателей Т-хелперов, для которых были показаны статистически значимые различия между облучёнными лицами и группами сравнения, с накопленными дозами облучения ККМ и тимуса и периферических лимфоидных органов. Для анализа связи показателей Т-звена с дозами облучения группа облучённых in utero была объединена с группой сравнения 1.

В объединённой группе исследования было выявлено статистически значимое снижение Tem с увеличением накопленной дозы облучения ККМ (p=0,003) и накопленной дозы облучения тимуса и периферических лимфоидных органов (p=0,005), но стоит отметить, что связь между этими показателями довольно слабая: коэффициент корреляции в первом случае составил всего -0,30, во втором составил -0,28. Также выявлено слабое снижение относительного количества Т-хелперов периферической крови с увеличением накопленной дозы облучения тимуса и периферических лимфоидных органов (SR=-0,20, p=0,04). При этом обнаружена слабая корреляционная связь между дозами облучения и относительным количеством T Naive : частота данных клеток возрастает с увеличением накопленной дозы облучения ККМ (SR=0,25, p=0,01) и накопленной дозы облучения тимуса и периферических лимфоидных органов (SR=0,23, p=0,02).

Был проведён аналогичный корреляционный анализ между показателями Т-хелперов, T Naive и T CM и T EM и накопленными дозами облучения, полученными в период внутриутробного развития, в объединённой группе исследования. Не было получено статистически значимых корреляционных связей между исследуемыми показателями и накопленными дозами облучения ККМ и тимуса и периферических органов в период внутриутробного развития.

Основным радионуклидом, формирующим дозу облучения, был 90Sr, накапливающийся преимущественно в костях человека и, вследствие этого, облучающий ККМ – основной орган кроветворения и иммунной системы. В условиях антенатального облучения, приходящегося и на период закладки органов, функция гемопоэтических стволовых клеток может быть нарушена. С возрастом же происходят и инволюционные изменения иммунной системы, проявляющиеся у необлучённых лиц в снижении количества наивных Т-клеток и Т-хелперов центральной памяти и увеличении эффекторных клеток [17]. Однако полученные нами результаты показывают увеличение наивных Т-клеток и снижение Т-хелперов эффекторной памяти у облучённых внутриутробно лиц на фоне пожилого возраста, что может свидетельствовать о включении адаптивных процессов, направленных на поддержание стабильной функциональности иммунной системы.

Оценка представленности трёх субпопуляций Т-хелперов (Th1, Th2 и Th17) в популяциях Tcm и Т ЕМ у обследуемых лиц представлены на рис. 2А и 2Б соответственно.

Было обнаружено статистически значимое увеличение относительного количества Т-хелперов 1 типа в популяциях TCM (M±SE: 32,89±1,76%) и Тем (M±SE: 51,77±2,97) относительно группы сравнения 2 (M±SE: 28,18±1,84; p=0,04; и M±SE: 42,80±2,70; p=0,02 соответственно). При этом, статистически значимых различий данного показателя с группой сравнения 1 обнаружено не было. Для других показателей не было выявлено статистически значимых различий между исследуемой группой и группами сравнения (рис. 2А и 2Б).

Субпопуляции в составе Т-хелперов центральной памяти

Рис. 2. Относительное количество субпопуляций Т-хелперов в популяциях T CM (А) и Тем (Б) у обследуемых лиц (среднее ± ошибка среднего).

Также не было обнаружено статистически значимых корреляций относительного количества Т-хелперов 1, 2 и 17 типов с накопленными дозами облучения ККМ и тимуса и периферических лимфоидных органов.

Облучение в малых дозах может вызывать сдвиг иммунной системы в сторону Th1-ответа и супрессию Th2-ответа, наблюдаемый у иранских лаборантов-радиологов, облучённых в дозах ниже 50 мЗв [18]. Недавнее обследование жителей Хиросимы, переживших атомную бомбардировку, показало увеличение количества популяций Т-хелперов с высокой экспрессией маркера CXCR3, определяющего фенотип Т-хелперов 1 типа, как с возрастом облучённых лиц, так и дозой облучения этих лиц [19]. Но следует сказать, что приведённые выше исследования включали лиц, облучённых постнатально, и характер и дозы облучения принципиально отличались от описываемой нами ситуации. Более ранние исследования лиц, подвергшихся облучению во внутриутробном периоде вследствие сброса ЖРО в реку Течу, выявили функциональные изменения в иммунной системе, не приводящие к существенным иммуносупрессивным процессам [20]. Обнаруженное нами увеличение количества Т-хелперов 1 типа может рассматриваться как некоторый сдвиг в сторону провоспалительного профиля, который, однако, не имеет серьёзного влияния на состояние иммунитета в масштабе организма.

Дифференцировка Т-хелперов происходит под влиянием различных компонентов клетки и окружающей её среды, в частности, одну из важнейших ролей играют транскрипционные факторы. Так, например, TBX1 считается главным транскрипционным фактором Т-хелперов 1 типа, при этом ингибирующим дифференцировку клеток в Т-хелперы 2 и 17 типов [21].

Поскольку ионизирующее излучение способно модулировать экспрессию факторов транскрипции, координирующий иммунный ответ [22], задачей второго этапа исследования заключалась в анализе экспрессии мРНК генов STAT3, GATA3, MAPK8, NFKB1, TBX21 и RORC, участвующих в регуляции дифференцировки Т-хелперов, у лиц, подвергшихся внутриутробному и постнатальному облучению. Результаты анализа представлены на рис. 3.

Не было обнаружено статистически значимых различий между обследуемыми группами людей в уровне экспрессии изучаемых генов, однако на уровне тенденции отмечено увеличение транскрипционной активности гена TBX21 у лиц, облучённых in utero (p=0,1).

Рис. 3. Относительная экспрессия исследуемых генов у обследуемых лиц (среднее ± ошибка среднего).

Продукт гена TBX21 (T-bet) является важным регулятором эффекторной дифференцировки и функции во многих различных иммунных линиях, включая CD4, CD8, NKT, ILC (включая NK) и B-клетки, в том числе Th1 и Th2, где играет ключевую роль в регуляции их функций [23]. Кроме того, другие популяции Th-клеток, включая Т-фолликулярные хелперы и Th17, а также регуляторные Т-клетки могут кооптировать экспрессию T-bet, чтобы способствовать функциональной диверсификации и колокализации клеток [24].

Зафиксированы статистически значимые слабые положительные корреляционные связи между относительным содержанием мРНК гена GATA3 и накопленной поглощённой дозой облучения ККМ (R=0,14, p=0,04) и NFKB1 и накопленной поглощённой дозой облучения тимуса и периферических лимфоидных органов (R=0,29, p=0,02). Регрессионный анализ не позволил отметить линейной зависимости от дозовых показателей (накопленной поглощённой дозой облучения ККМ, тимуса и периферических лимфоидных органов) для этих генов.

Необходимо отметить, что транскрипционные факторы T-bet и GATA3 являются прямыми факторами, стимулирующими дифференцировку Th1 и Th2. Если Т-bet отказывает непосредственное влияние на дифференцировку наивных Т-лимфоцитов в Th1, то GATA3 участвует в регуляции высвобождения цитокинов из Th2 [25].

Анализ зависимости относительного количества клеток Th1, Th2 и Th17 в субпопуляциях Т-хелперов центральной и эффекторной памяти от экспрессии мРНК исследуемых в рамках настоящей работы генов не позволил отметить статистически значимых связей.

Таким образом, наблюдаемые нами изменения в Т-звене позволяют сделать предположение о своеобразных адаптационных процессах иммунной системы лиц, облучённых внутриутробно и постнатально: иммунная система вынуждена противостоять угнетению менее дифференцированных клеток, происходящему вследствие облучения, в условиях старения.

Заключение

Исследование, проведённое через 60-70 лет после начала хронического облучения, выявило дозозависимое снижение общего количества Т-хелперов, Т-хелперов эффекторной памяти и Т-хелперов центральной памяти и увеличение относительного количества наивных Т-хелперов в периферической крови лиц, облучённых во внутриутробном и постнатальном периодах. Следует отметить, что в рамках проведённого исследования не удалось выявить существенного влияния облучения людей во внутриутробном периоде на показатели Т-хелперного звена иммунной системы, а обнаруженные нами изменения были связаны с накопленными дозами облучения, полученными в постнатальном периоде. В то же время отмечено увеличение относительного количества клеток Т-хелперов 1 типа у облучённых внутриутробно и постнатально относительно группы лиц, облучённых только в постнатальном периоде, причём данные изменения не зависели от накопленных доз облучения. Подобные изменения внутри популяции Т-хелперов могут служить маркером некоторого провоспалительного сдвига у облучённых лиц, однако для подтверждения данной гипотезы необходимы дальнейшие исследования.

Не было выявлено статистически значимых различий в транскрипционной активности генов – регуляторов дифференцировки Т-хелперов: GATA3, STAT3, TBX21, MAPK8 и RORC между обследуемыми группами людей. Не обнаружено корреляционных связей между экспрессией генов регуляторов и относительного количества субпопуляций Т-хелперов у обследованных людей в отдалённые сроки после начала хронического радиационного облучения.