Особенности углеводного и водно-солевого обменов крыс с экспериментальной моделью сахарного диабета на фоне приема электроактивированных водных растворов

Все права защищены

2(12) 2013

ISSN 2226-3365

По данным ВОЗ, в настоящее время в мире насчитывается 285 млн больных СД, а к 2025 г. их количество составит 380 млн и 435 млн – в 2030 г. При этом реальные темпы прироста заболеваемости значительно опережают даже столь удручающие прогнозы статистиков. Так, в 2000 г. количество больных СД оказалось на 11 % больше – 175 млн. против 154 млн. по расчетным данным 1998 г. [1, с. 1–13].

Поиск новых эффективных способов лечения СД является одной из важнейших проблем мировой медицины и здравоохранения [2, с. 160; 14, с. 33–40]. Одним их возможных способов решения данного вопроса является использование электроактивированных водных растворов (ЭВР) [3].

Электрохимическая активация (ЭХА) – сравнительно новая отрасль в медицине, открывающая широкие возможности применения водных растворов, обработанных электрическим током, в качестве лекарственных средств в эксперименте и в клинике [4, с. 88–91; 5, с. 54; 6, с. 26; 7, с. 23–25].

Реализуется ЭХА путем анодной или катодной (униполярной) активации солевого раствора в электроактиваторе, представляющим собой в общем случае разновидность диафрагменного электролизера [8, с. 317–319]. «Анолит» (кислотная вода, бактерицид) характеризуется электронноакцепторными свойствами, способен стимулировать биологическое окисление, к тому же он способствует непрямой электрохимической детоксикации организма путем окислительного гидроксилирования токсинов и шлаков [9, с. 15–23]. «Католит» (щелочная вода, биостимулятор) обладает антиоксидантными, иммуностимулирующими, детоксицирующими свойствами, нормализует метаболические процессы (повышение синтеза АТФ, изменение активности ферментов), стимулирует регенерацию тканей, улучшает трофические процессы и кровообращение в тканях, усиливает детоксикационную функцию печени [10, с. 5].

В настоящее время в медицине накоплено достаточно фактов значимости феномена ЭХА для регуляции физиологического гомеостаза, о возможности биофизического управления тонкой структурной организацией воды в составе живых тканей и процессами электронного обмена в биологических субстратах. Благодаря этому ЭХА-вода, ее растворы и другие электроактивированные жидкие среды достаточно широко используются во многих странах мира как профилактическое и терапевтическое средство для лечения широкого круга заболеваний [1, с. 1–13].

Несмотря на то, что в настоящее время имеются многочисленные публикации об использовании ЭВР в клинической медицине [12, с. 4–5; 12, с. 85], их механизмы действия и фармакологические эффекты изучены далеко не полностью.

В свете этой проблемы особую актуальность имеет изучение воздействия водных растворов на организм в норме и при сахарном диабете.

Методика . В работе использована аллоксановая модель сахарного диабета, впервые полученная в 1943 г. Экспериментальная модель сахарного диабета создавалась посредством однократного введения 10 % раствора аллоксана из расчета 0,1мл/100 г массы тела.

В работе использовались 49 взрослых крыс линии Wistar массой 200–250 г., разделенных на 2 равные группы – контрольную и экспериментальную, каждая из которых, в свою очередь, была поделена на

Все права защищены

2(12) 2013

ISSN 2226-3365

три подгруппы: животные, получающие воду, раствор католита (ЭВР-К) или анолита (ЭВР-А).

На 1, 3 и 6 сутки эксперимента у животных брали пробы крови путем надсечки хвоста для определения уровня глюкозы. На 6 сутки животных высаживали в обменные клетки для сбора мочи. В конце эксперимента у всех животных под эфирным наркозом из нижней полой вены забирали пробы крови объемом 5 мл для последующего физикохимического анализа показателей, а также образцы тканей поджелудочной железы и почки.

Для определения уровня глюкозы к 0,1 мл. плазмы крови добавлялось 0,9 мл дистиллированной воды и 0,5 мл пикриновой кислоты (1,2 % р-р), тщательно перемешивали и центрифугировали в течение 10 минут при скорости вращения 3000 об/мин. Затем к 1 мл центрифугата приливали 0,2 мл гидроксида натрия (20 % р-р) и помещали в кипящую водяную баню на 5 минут. После охлаждения, растворов фотометрировали при длине волны 560 нм на спектрофотоколориметре «Spekol». Концентрацию глюкозы определяли по стандартной кривой.

Концентрацию глюкозы в моче определяли тем же способом. Моча предварительно разводилась от 10 до 50 раз в зависимости от концентрации в ней глюкозы.

Концентрацию ионов Na+ и K+ в моче, плазме крови определяли методом пламенной фотометрии с использованием фотометра «BMW Technologies» производства США.

Для определения осмотической концентрации мочи и плазмы крови использовали метод криоскопии. Измерения выполняли на миллиосмометре «OSMOMAT», производство Германия.

Концентрацию осмотически активных веществ в пробах определяли по калибровочным графикам, построенным на основании показаний прибора при измерении стандартных растворов мочевины с известной осмолярностью (300, 1000, 2000 мосм/л).

Парциальные функции почек рассчитывали по общепринятым формулам [14, с. 293].

Для светооптического исследования образцы поджелудочной железы и почек фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина, обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и заключали в парафин. Срезы толщиной 5–6 микрон, окрашивали гематоксилином Майера, эозином, альциановым синим и заключали в канадский бальзам.

Статистический анализ результатов исследования проводился на основе определения средне арифметических (М) и их ошибок (±m). Различие показателей оценивалось методами вариационной статистики по t-критерию Стьюдента и считались достоверными при p≤0,05, также использовались критерии Anova. Расчеты производились по общепринятым формулам с использованием стандартных программ пакета Microsoft Office.

Все животные находились в стандартных условиях вивария при свободном доступе к воде или соответствующему раствору и пище. Полученные результаты обработаны общепринятыми методами статистики (Statistica-6.0).

Результаты. На первом этапе исследования был проведен анализ концентрации глюкозы в плазме крови крыс в динамике развития экспериментального сахарного диабета (табл.1).

Все права защищены

2(12) 2013

ISSN 2226-3365

Таблица 1

Время эксперимента, сутки	Контроль (интактные)			СД
	вода	ЭВР-А	ЭВР-К	вода	ЭВР-А	ЭВР-К
1	6,7±0,39	6,5±0,35	6,6±0,18	14,7±3,4*	7,06±1,15▲ Δ	23,06±4,03*
3				18,1±4,0*	9,3±1,4▲ Δ	23,18±5,01*
6				16,1±5,3	11,2±3,2	12,05±2,8

Примечание (здесь и далее):

* – достоверные отличия от аналогичных показателей контроля (р ≤0,05) ;

Δ – достоверные отличия между экспериментальными группами (католит, анолит) (р ≤0,05);

▲ – достоверные отличия по сравнению с группой «вода» (р ≤0,05).

Концентрация глюкозы в плазме крови крыс (M±m), ммоль/л

Из данных табл. 1 видно, что у здоровых животных «католит» и «анолит» не вызывали изменения уровня глюкозы в крови на протяжении всего периода наблюдения. У животных экспериментальной группы уже на первые сутки после инъекции аллоксана уровень глюкозы был достоверно выше аналогичных показателей контроля, что свидетельствовало о развитии сахарного диабета. Только в группе «ЭВР-А» этот показатель был достоверно ниже показателей остальных групп и достоверно не отличался от контроля. Подобная ситуация сохранилась на 3 сутки эксперимента. На 6 сутки наблюдения уровень глюкозы у всех экспериментальных животных достоверно не различался между группами и был в 2 раза выше интактных животных.

Таким образом, можно заключить, что у здоровых животных ЭВР не вызывали изменений уровня глюкозы в крови, тогда как на фоне сахарного диабета ЭВР-А оказывал выраженный гипогликемический эффект, вызывая задержку развития сахарного диабета, тогда как ЭВР-К не проявлял протективного сахаропонижающего эффекта.

При анализе ионно-осмотических показателей плазмы крови и мочи крыс было выявлено, что у интактных животных различные водные растворы не вызывали существенных изменений концентрации ионов и показателей функций почек, кроме снижения мочевины в плазме крови после приема ЭВР-А. На фоне сахарного диабета концентрация натрия и калия не изменялись, а содержание мочевины имело тенденцию к повышению, и уровень креатинина был достоверно выше аналогичных показателей здоровых животных. Полученные изменения могут свидетельствовать о нарушении функционального состояния почек и развитии почечной недостаточности в условиях СД. При этом существенных отличий между животными, принимавшими разные ЭВР, не обнаружено, за исключением некоторого увеличения концентрации креатинина и гипокалиемии после приема ЭВР-К (табл. 2).

Все права защищены

2(12) 2013

ISSN 2226-3365

Таблица 2

Ионно-осмотические показатели плазмы крови крыс (M±m)

Концентрация, ммоль/л	контроль			СД
	вода	ЭВР-А	ЭВР-К	вода	ЭВР-А	ЭВР-К
натрия	139,4±13,5	138,3±12,1	129,7±13,0	148,0±23,7	124,0±8,6	131,0±34,1
калия	4,1±0,2	3,9±0,2	4,0±0,3	3,8±0,2	3,6±0,3	3,0±0,3*▲
креатинина	1,14±0,04	1,1±0,05	1,09±0,02	1,4±0,03*	1,4±0,04*	1,5±0,01*▲ Δ
мочевины	54,0±4,9	33,8±5,6▲ Δ	49,8±4,8	60,0±7,7	64,8±7,2*	63,6±8,7

Примечание: см. таблицу 1

Изучение гидро- и ионоуретической функций почек позволило выявить увеличение уровня диуреза на фоне сахарного диабета в группах животных, принимавших как «анолит», так и «католит» (табл. 2). Скорость клубочковой фильтрации и уровень канальцевой реабсорбции не отличались между группами СД и контроля. Параллельно возрастала экскретируемая фракция калия, что, вероятнее всего, отражало увеличение секреции катиона. Указанные факты свидетельствуют в пользу усиления экскреции осмотически активных веществ (например, глюкозы) под влиянием ЭВР в условиях СД, в результате чего повышалась скорость мочеотделения и очищение калия, а концентрация глюкозы в плазме была ниже, чем у животных, получающих воду и ЭВР-А.

Поскольку функциональные изменения органа обусловлены изменением его морфологической структуры, на следующем этапе нашего исследования был проведен анализ морфологической структуры поджелудочной железы и почек животных.

Таблица 3.

Гидро- и ионоуретическая функции почек крыс (M±m)

Показатель	контроль			СД
	вода	ЭВР-А	ЭВР-К	вода	ЭВР-А	ЭВР-К
V, мл/100г*час	0,05±0,02	0,03±0,01	0,04±0,01	0,06±0,01	0,11±0,02*▲	0,11±0,03*
СКФ, мл/100г*час	13,7±3,4	20,6±2,12	12,2±2,5 Δ	10,4±2,0	15,2±3,7	12,2±4,9
R H 2 O, %	99,6±0,1	99,7±0,03	99,6±0,09	99,6±0,04	99,7±0,1	99,0±0,6
U Na *V, мкмоль/100г* час	4,0±1,5	13,7±0,6▲ Δ	7,0±2,8	4,3±1,6	6,8±2,4*	16,5±5,5 Δ

Все права защищены

2(12) 2013

ISSN 2226-3365

U K *V, мкмоль/100г*час	15,6±6,4	12,0±1,5	8,9±3,1	17,1±8,6	16,6±1,07	17,1±6,7
EF Na , %	0,2±0,1	0,4±0,05	0,4±0,2	0,3±0,09	0,3±0,10	2,11±0,97
EF K , %	22,8±10,2	15,03±3,3	13,06±2,8	54,2±6,2	40,6±2,2*	58,5±11,8*

Примечание: см. таблицу 1

Анализ структурной организации поджелудочной железы крыс контрольной группы показал, что структура органа соответствует норме: клетки расположены довольно равномерно с хорошо контурируемыми ядрами.

Анализ структурной организации поджелудочной железы крыс в условиях аллоксановой модели сахарного диабета показал, что происходит блокада протоков разных уровней, слабо выраженный кистоз, а также отмечен междольковый отек. Экскреторная паренхима железы при диабете атрофична, строение ее стерто.

При анализе структурной организации поджелудочной железы крыс с аллоксановой моделью сахарного диабета после приема ЭВР-А обнаружена кольцевидная трансформация ацинуса, гипертрофия островков Лангерганса, субнекроз. Иная картина наблюдалась в структурной организации поджелудочной железы крыс, употреблявших ЭВР-К при аллоксановой модели сахарного диабета. Наряду с кольцевидной трансформацией ацинуса, гипертрофией островков Лангерганса, субнекрозом, которые наблюдались в группе СД+ЭВР-А, отмечена гипертрофия и гиперплазия островков Лангерганса, междольковый отек, очаговые некрозы ткани, псевдокистоз, а также соединительнотканное замещение ацинусов, элементы жировой атрофии, тяжелый протеолиз в сочетании с липолизом (рис. 1).

Почки практически всех животных контрольной группы имели нормальную структурную организацию. Отчетливо обозначены корковое и мозговое вещество почечной паренхимы. Проксимальные и дистальные канальцы нефрона сохраняют свое трубчатое строение. Ядра нефроцитов хорошо прокрашены ядерными красками, четко различимы. Собирательные трубки расположены компактно, не расширены. Эпителий кубический с хорошо видимыми и прокрашенными ядрами округлой и округлоовальной формы. Анализ структурной организации почек крыс с аллоксановой моделью сахарного диабета после приема ЭВР-А показал кистозную множественную трансформацию, гидрофическую дистрофия канальцев, выраженную полифибропласти-ческую реакцию на уровне капилляров, канальцевые некрозы, начинаются фибропластические реакции.

В почках крыс с аллоксановой моделью сахарного диабета после приема ЭВР-К обнаружен слабо выраженный кистоз, гидрофическая дистрофия, акцентированная на проксимальных канальцах, ячеистая структура на фоне тотальных некрозов, очаговый некроз с плазматическим пропитыванием интерстиция (рис. 2).

Было установлено, что во всех экспериментальных группах по сравнению с контролем наблюдались некротические изменения, вызванные интоксикацией аллоксаном. При этом у животных, которые

Все права защищены

2(12) 2013

ISSN 2226-3365

пили ЭВР-А, в структуре поджелудочной железы по сравнению с другими экспериментальными группами отмечались минимальные изменения органа (рис. 1).

Морфологическая структура поджелудочной железы

Рисунок 1.

На фоне аллоксанового диабета в почках животных всех экспериментальных групп по сравнению со здоровыми животными обнаружены тяжелые последствия аллоксановой интоксикации. Регенерирующее действие ЭВР на почки в ходе эксперимента не установлено (рис. 2).

Рисунок 2.

Морфологическая структура почки

Таким образом, прием электрохимически активных водных растворов не вызывает изменений функций почек и водно-солевого обмена у здоровых животных, тогда как при сахарном диабете увеличение диуреза и экскретируемой фракции калия после приема ЭВР требует дальнейшего изучения. В то же время «анолит» на фоне изучаемой патологии способствует задержке развития данного заболевания, что проявляется в более низких показателях уровня глюкозы в крови, тогда как «католит» не оказывает подобного протективного эффекта. Гистологический анализ показал положительное влияние «анолита» на структуру поджелудочной железы крыс с аллоксановой моделью сахарного диабета. Полученные данные

Все права защищены

2(12) 2013

ISSN 2226-3365

требуют исследования биохимических гипогликемический и протективный эффекты процессов, определяющих подобный «анолита».