Особенности воспалительной реакции в микроокружении плоскоклеточных карцином головы и шеи

Плоскоклеточные карциномы области головы и шеи являются одними из наиболее часто встречающихся опухолей данной локализации. Такие опухоли отличаются высокой вариабельностью морфологического строения, когда у одного и того же пациента наблюдается сочетание клеток разной степени дифференцировки. В зависимости от преобладающей дифференцировки плоскоклеточный рак головы и шеи делят на высоко-, умеренно- и низкодифференцированный варианты в соответствии с рекомендациями ВОЗ (2005). Обращает на себя внимание, что опухолевые клетки расположены не хаотично, а в определенных устойчивых сочетаниях, образуя домены или структуры, разделенные стромой. Эти структуры в зависимости от формирующих их клеток также могут быть высоко- или низкодифференцированными. Всего нами предложено выделять 5 типов доменов клеток: с ороговением в центре (формирующие «жемчужины»), с шиповатыми клетками без ороговения, с клетками базалоидного типа, низкодифференцированные высокополиморфные структуры и дискретно расположенные одиночные опухолевые клетки [1]. Наблюдения показывают, что опухоль может быть представлена как одним типом структур, так и различным их сочетанием. Мы изучили ассоциацию этих структур с клиникоморфологическими характеристиками заболевания и показали, что наличие одиночных опухолевых клеток сопряжено с повышенным метастатическим потенциалом плоскоклеточной карциномы [2].

Тип структуры, степень дифференцировки составляющих ее клеток, по крайней мере частично, могут зависеть от условий микроокружения. Многочисленные исследования позволили выделить три ключевых компонента опухолевого микроокружения, оказывающих влияние на течение опухолевой болезни: экстрацеллюлярный матрикс, сосудистую сеть и инфильтрат иммунных клеток [3, 4]. Различное сочетание этих факторов обеспечивает разнообразие влияния на опухолевые клетки, что способствует возникновению внутри-опухолевой гетерогенности [5].

Проведенное нами ранее исследование [2] показало, что лимфогенное метастазирование наблюдалось чаще не только в опухолях с наличием одиночно расположенных опухолевых клеток (структуры 5-го типа) и высокополиморфных клеток (структуры 4-го типа), но и у пациентов со сниженным уровнем воспалительного инфильтрата в паренхиме опухоли, который, в свою очередь, был ассоциирован с наличием структур 5-го типа. Поэтому естественным продолжением работы стала попытка подробнее изучить характер воспалительного инфильтрата у пациентов с учетом морфологической гетерогенности плоскоклеточных карцином.

Цель исследования – оценить уровень CD4⁺ и CD8⁺ T-лимфоцитов, В-лимфоцитов, макрофагов и клеток Лангерганса (КЛ) в плоскоклеточных карциномах области головы и шеи в зависимости от наличия разных типов клеточных структур и параметров опухолевого роста и метастазирования.

Материал и методы

Материалом исследования служили образцы опухоли от 44 пациентов с плоскоклеточным раком головы и шеи T1–4N0–3M0 стадии различных локализаций, получавших лечение в НИИ онкологии Томского НИМЦ в период с 2007 по 2016 г. Поражение гортани и гортаноглотки диагностировано у 34 (77,2 %), ротоглотки и ротовой полости – у 10 (22,8 %) пациентов. Во всех случаях диагноз верифицирован морфологически. Никто из пациентов специфического лечения до биопсии не получал. Исследование проходило в соответствии с Хельсинкской декларацией 1964 г. (исправленной в 1975 и 1983 гг.) и с разрешения локального этического комитета института, все пациенты подписали информированное согласие на исследование. Из данных канцер-регистра и амбулаторных карт были получены сведения о поле, возрасте пациентов и распространенности по TNM плоскоклеточных карцином. Выраженность воспалительного инфильтрата оценивалась в процентах площади стромы, инфильтрированной лимфоцитами, от общей площади стромы, по аналогии с рекомендациями Международной рабочей группы [6]. Анализ морфологической гетерогенности плоскоклеточных карцином проводился методом световой микроскопии на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином. Оценка уровня CD4+ и CD8+ T-лимфоцитов, В-лимфоцитов и макрофагов осуществлялась при помощи иммуногистохимического окрашивания срезов с применением первичных антител к CD3 (клон LN10, Leica, Германия), CD4 (клон 4B12, Dako, США), CD8 (C8/144B, Dako, США), CD20 (клон L26, Dako, США), CD68 (клон PG-M1, Dako, США), результат выражался в процентах. В каждом из четырех типов многоклеточных структур плоскоклеточной карциномы подсчитывалось количество дендритных клеток Лангерганса с длинными, короткими и средней величины отростками. Для этой цели использовались антитела к CD1а (клон MTB1, Leica, Германия) и S100 (поликлональное, Leica, Германия).

На каждом срезе подсчет проводился минимум в 10 полях зрения, после чего вычислялась медиана.

Для проверки статистически значимой разницы результатов в исследуемых группах использовались непараметрический критерий Манна–Уитни, коэффициент корреляции по Спирмену.

Результаты

Сопоставление наличия и количества дендритных клеток (ДК) в многоклеточных структурах 2–4-го типов с клеточным составом воспалительного инфильтрата не выявило корреляции между этими показателями. Напротив, обнаружена прямая корреляция между количеством CD1α+ ДК в структурах 1-го типа с общим количеством CD3+ Т-клеток (r=0,78, р=0,037) и с долей в инфильтрате CD4+ Т-лимфоцитов-хелперов (r=0,84, р=0,017). Прямая корреляция с количеством CD4+ таблица 1

Связь воспалительного инфильтрата в строме плоскоклеточных карцином с типом опухолевых структур (%, Me (Q1-Q3))

Характеристика вос-	1-й тип	2-й тип	3-й тип	4-й тип	5-й тип
палительной инфиль-	Нет    Есть	Нет    Есть	Нет    Есть	Нет    Есть	Нет    Есть
трации	(n=23)   (n=21)	(n=7)    (n=37)	(n=25)   (n=19)	(n=20)   (n=24)	(n=30)   (n=14)
Выраженность вос-	40        40	40        40	40        42	55        40	50        40
паления	(35; 65)    (40; 60)	(37,5; 70) (38,8; 60)	(37,5; 60) (37,5; 70)	(40; 68,8) (31,3; 50)	(40; 70)    (35; 40)
p	0,849	1,0	0,692	0,003	0,01
	50        40	40        50	55         40	50        45	50        40
CD3+	(20; 60)   (17,5; 60)	(10; 40)   (22,5; 60)	(32,5; 82,5)      (15; 60)	(16,3; 60) (28,8; 70)	(27,5; 60) (18,8; 60)
p	0,522	0,171	0,062	0,924	0,409
	5          10	5          10	10        10	10         6,3	10         6,3
CD4+	(5; 12,5)    (5; 22,5)	(5; 7,5)     (5; 20)	(5; 20)    (5; 12,5)	(5; 18,1)    (5; 18,8)	(5; 20)     (5; 16,3)
p	0,144	0,077	0,342	0,482	0,453
	20        10	10         15	20        10	15         15	15         10
CD8+	(10; 25)     (5; 20)	(5; 20)    (10; 22,3)	(10; 27,5)    (5; 20)	(5; 27,5)    (10; 20)	(10; 20)   (5; 21,3)
p	0,614	0,826	0,1	0,718	0,36
	1             5	1             5	5             1	1             5	1             5
CD20+	(1; 7,5)    (1; 11,3)	(1; 1)      (1; 10)	(1; 10)      (1; 10)	(1; 9,4)     (1; 10)	(1; 8,1)    (1; 10,6)
p	0,16	0,134	0,494	0,653	0,364
CD68+	5           5	5           5	5           5	5           5	5           5
	(1; 5)      (5; 10)	(1; 10)     (5; 7,5)	(1; 5)      (5; 10)	(2; 6,9)     (5; 10)	(4; 7,5)     (4; 10)
p	0,335	0,66	0,09	0,744	0,61
СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ.		2018; 17(6): 57–63			59

Т лимфоцитов-хелперов подтверждается и при выявлении в структурах 1-го типа ДК антителами к S100 (r=0,78, р=0,037).

Результаты оценки выраженности и клеточного состава воспалительной инфильтрации в строме плоскоклеточных карцином представлены в табл. 1.

Согласно полученным данным, уменьшение выраженности воспалительного инфильтрата ассоциировано с клеточными структурами 4-го типа, которые представляют собой кластер клеток, и 5-го типа одиночными клетками опухоли. Оба типа структур имеют низкую степень дифференцировки и высокий уровень полиморфизма. Выявлен ряд изменений на уровне тенденций. При наличии структур 1 и 2-го типов инфильтрата была больше доля CD4+ Т-лимфоцитов и CD20+ В-лимфоцитов. При наличии в опухоли структур 3-го типа, наобо- рот, обнаружено уменьшение относительного количества CD3+ и CD8+ Т-лимфоцитов.

Поскольку ранее была показана выраженная связь низкого уровня воспалительной инфильтрации с лимфогенным метастазированием [2], особый интерес представлял анализ его клеточного состава в зависимости от распространенности злокачественного процесса и поражения регионарных лимфоузлов метастазами (T- и N-критерий по TNM-классификации опухолей) (табл. 2).

Результаты свидетельствуют, что при значениях величин опухоли, соответствующих T3-4, степень воспалительной инфильтрации меньше на уровне тенденции, чем при T1-2. Величина опухоли не была связана с наличием изучаемых популяций клеток воспалительного инфильтрата. Обнаружена связь воспалительной инфильтрации с лимфогенным метастазированием. У пациентов с N1-3 выражен- таблица 2

Характеристика воспалительной инфильтрации в зависимости от величины опухоли и лимфогенного метастазирования (%, Me (Q1-Q3))

Характеристика воспалительной инфильтрации (Tn=11–52)           (Tn=32–94)              p              (nN=208)           (Nn=11–63)              p Выраженность воспаления 55              40                              52,5             40 (40; 70)           (35; 55)            0,103            (40; 70)         (35; 41,5)           0,009 CD3+ 45              45                               55             22,5 (40; 60)           (20; 60)            0,671            (40; 60)           (15; 50)            0,021 CD4+ 5                 10                                    10                8,8 (5; 20)           (5; 17,5)            0,525             (5; 15)            (5; 20)             0,792 CD8+ 15                15                                    15                17,5 (5; 20)           (7,5; 25)            0,332             (5; 20)          (10; 28,8)           0,219 CD20+ 2,5                   1                                         3,8                   1 (1; 10)             (1; 10)             0,665             (1; 9,4)             (1; 10)              0,95 CD68+ (1; 10)             (5; 8,8)             0,544             (2; 9,4)            (5; 8,8)             0,907 таблица 3

Связь состава воспалительного инфильтрата с наличием разных типов опухолевых структур при отсутствии лимфогенных метастазов (в %, Me (Q1-Q3))

Клеточные элементы 1-й тип Нет      Есть (n=13)    (n=15) 2-й тип Нет      Есть (n=4)     (n=24) 3-й тип Нет      Есть (n=16)    (n=12) 4-й тип Нет     Есть (n=13)    (n=15) 5-й тип Нет      Есть (n=20)      (n=8) CD3+ p 55        55 (35; 70)    (40; 60) 0,525 40 (17,5;     57,5 58,8)     (40; 60) 0,59 55        50 (40; 72,5) (18,8; 60) 0,28 60        55 (25; 65)   (40; 60) 0,804 55        57,5 (32,5; 60) (41,3; 71,3) 0,636 CD4+ p 10         10 (5; 13,8)     (5; 20) 0,717 5          10 (5; 16,3)    (5; 15) 0,355 10         10 (5; 18,8)   (5; 11,9) 0,568 10         5 (7,5; 16,3)   (5; 15) 0,71 10          6,3 (5; 18,8)    (5; 13,8) 0,533 CD8+ p 20        10 (10; 20)    (5; 20) 0,185 15          15 (6,3; 20)    (5; 20) 0,975 15         12,5 (10; 20)    (5; 20) 0,45 15         15 (5; 20)     (5; 20) 0,576 15          15 (6,3; 20)    (5; 27,5) 0,823 CD20+ p 1            5 (1; 8,8)      (1; 10) 0,618 1              5 (1; 7,8)     (1; 9,4) 0,635 3          3,8 (1; 6,9)     (1; 11,9) 0,698 2,5         5 (0,5; 8,8)    (1; 10) 0,209 1,8           5 (1; 6,9)     (1; 11,9) 0,469 CD68+ p 5           5 (3; 7,5)      (1; 10) 0,618 7,5          5 (2; 13,8)    (2; 7,5) 0,645 5           5 (2; 6,9)     (2; 10) 0,478 5          5 (5; 8,8)     (1; 10) 0,576 5           5 (2; 9,4)      (2; 8,8) 0,709 таблица 4

Связь состава воспалительного инфильтрата с наличием разных типов опухолевых структур при наличии лимфогенных метастазов (в %, M (Q1; Q3))

Кле- 1-й тип 2-й тип 3-й тип 4-й тип 5-й тип точные Нет Есть Нет Есть Нет Есть Нет Есть Нет Есть элементы (n=10) (n=6) (n=3) (n=13) (n=9) (n=7) (n=7) (n=9) (n=10) (n=6) CD3+ 42,5 17,5 20 25 25 20 20 25 (17,5; 47,5 17,5 (18,8; 52,5) (13,8; 36,3) (10; ) (15; 55) (17,5; 60) (15; 45) (15; 60) 47,5) (18,8; 60) (13,8; 21,3) p 0,263 0,364 0,252 0,758 0,031 CD4+ 5 15 5 10 10 7,5 10 7,5 10 6,3 (4; 12,5) (6,9; 45) (5; ) (5; 20) (5; 30) (1; 20) (5; 20) (5; 20) (5; 20) (4; 25) p 0,093 0,146 0,47 0,918 0,713 CD8+ 17,5 15 5 20 (12,5; 25 10 30 15 22,5 10 (5; 31,3) (10; 32,5) (5; ) 32,5) (15; 35) (5; 15) (5; 35) (10; 22,5) (13,8; 35) (5; 21,3) p 1 0,025 0,023 0,47 0,093 CD20+ 1 7,5 1 5 5 1 1 5 1 3 (0,9; 6,3) (1; 16,3) (0; ) (1; 11,3) (1; 13,8) (0,5; 5) (1; 10) (0,8; 11,3) (0,9; 10,6) (1; 11,3) p 0,118 0,111 0,114 0,918 0,635 CD68+ 5 5 5 5 5 5 5 5 5 7,5 (1; 6,3) (5; 10) (1; ) (5; 7,5) (1; 5) (5; 10) (1; 5) (5; 10) (4; 5) (4; 12,5) p 0,368 0,9 0,091 0,174 0,263 ность воспалительной реакции была в 1,3 раза ниже, чем у больных с N0 (40 % и 52,5 % соответственно), главным образом за счет снижения количества CD3+ Т-лимфоцитов: у пациентов с N1-3 их количество было вдвое ниже по сравнению с пациентами с N0 (табл. 2). По нашим данным, количество CD20+ В-лимфоцитов и CD68+ макрофагов в опухоли не различалось у пациентов с T1-2/T3-4 и N0/N1-3.

Отдельно оценивали связь морфологической гетерогенности и условий опухолевого микроокружения с лимфогенным метастазированием. У пациентов с N0 зависимости параметров воспалительной инфильтрации от морфологической гетерогенности не было обнаружено (табл. 3). В противоположность этому у пациентов с N1-3 выявлена такая связь (табл. 4).

При наличии в опухоли структур 1 и 2-го типов увеличена доля CD4+ Т-лимфоцитов-хелперов и CD20+ В-лимфоцитов. В опухолях со структурами 2-го типа увеличено еще и относительное количество CD8+ цитотоксических лимфоцитов. В опухолях со структурами 3-го типа зависимость обратная: уменьшена доля CD8+ цитотоксических лимфоцитов и CD20+ В-лимфоцитов. Наконец, в опухолях с одиночными клетками (5-й тип структур) уменьшено общее количество CD3+ Т-клеток и среди них CD8+ цитотоксических лимфоцитов.

Обсуждение

Воспалительная инфильтрация плоскоклеточных карцином встречается постоянно и, как правило, достаточно выражена. Результаты исследования демонстрируют связь проявлений воспалительной реакции с гетерогенностью морфологического строения плоскоклеточных карцином. Причем это касается как дендритных клеток, располагающихся среди опухолевых клеток многоклеточных кластеров, так и лейкоцитов, инфильтрирующих строму опухоли. ДК опухолевых структур, подобно ДК нормального плоского эпителия, способны воспринимать воздействия антигенов и Toll-лигандов, тем самым участвуя в развитии иммуновоспалитель-ных реакций как врожденного, так и адаптивного типов [7]. Происходит это, в частности, благодаря синтезу КЛ провоспалительных цитокинов, например TNF-а и IL-12. Прямая корреляция между количеством ДК в структурах 1-го типа и общим количеством Т-клеток и CD4+ Т-хелперов в строме опухоли соответствует описанной выше закономерности. Связь КЛ с воспалительной, преимущественно лимфоидной инфильтрацией описана при раке гортани. Высокое содержание Т-лимфоцитов и дендритных клеток рассматривается как благоприятный прогностический фактор, повышающий общую выживаемость пациентов [8, 9].

Примечательно, что корреляция количества клеток воспалительного инфильтрата имеется только с ДК в высокодифференцированных структурах 1-го типа, но не с ДК менее дифференцированных структур 2–4-го типов. Это обстоятельство, по-видимому, можно трактовать как косвенный аргумент в пользу предположения о том, что для полноценного функционирования ДК должны взаимодействовать с высокодифференцированными клетками плоского эпителия. В определенной степени предположение подтверждается данными исследований, в которых показано, что наибольшее количество КЛ обнаруживалось в высокодифференцированных опухолях, наименьшее – в низкодифференцированных новообразованиях [10].

Наши результаты демонстрируют положительную роль воспалительной инфильтрации, поскольку при большей распространенности опухоли (Т3–4) и наличии лимфогенных метастазов (N1–3) наблюдалось уменьшение степени инфильтрации стромы плоскоклеточных карцином. Лимфогенное метастазирование было ассоциировано еще и с уменьшением в инфильтрате общего количества Т-клеток.

Внутриопухолевая гетерогенность морфологического строения плоскоклеточных карцином характеризуется основным признаком – степенью дифференцировки опухолевых клеток, строящих соответствующие структуры. Важно подчеркнуть, что структуры разной степени дифференцировки формируются в одной опухоли. Оценка связи гетерогенности морфологического строения плоскоклеточных карцином и воспалительной инфильтрации позволяет обсуждать роль степени дифференцировки опухолевых элементов в структурах в формировании воспалительного микроокружения. Первым аргументом в пользу существования такой зависимости служит обсуждаемая выше корреляционная зависимость между КЛ в высокодифференцированных структурах опухоли и CD4+ Т-хелперами в инфильтрате. Дополнительными аргументами являются большая степень инфильтрации стромы CD4+ Т-хелперами при наличии высокодифференцированных структур 1 и 2-го типа и уменьшение общей воспалительной инфильтрации при наличии низкодифференцированных структур 4 и 5-го типов. При наличии структур 3-го типа (тоже низкой степени дифференцировки) в инфильтрате была меньше доля CD3+ и CD8+ лимфоцитов.

Таким образом, можно предполагать, что высокодифференцированные клеточные кластеры плоскоклеточных карцином напрямую связаны с более выраженной общей воспалительной реакцией или большим относительным количеством Т-лимфоцитов. Причем воспалительная инфильтрация в такой ситуации коррелирует с количеством клеток Лангерганса. Остается открытым