Особенности выделения белков для анализа протеома растений гороха Pisum sativum L. при симбиозе с клубеньковыми бактериями

Горох посевной Pisum sativum L. - удобная модель для изучения молекулярно-генети-ческих механизмов становления азотфиксирующего симбиоза с клубеньковыми бактериями, поскольку для этого вида создана представительная коллекция мутантов с нарушением процесса развития симбиоза на разных стадиях. Сравнительный анализ протеомов у исходных сортов, линий гороха и мутантов может быть удобным подходом при выявлении и анализе регуляторов, контролирующих процесс образования азотфиксирующих клубеньков. Однако, как показывает обзор данных литературы, дифференциальные изменения протеома корней гороха при симбиозе почти не изучались. Подготовка проб - ключевой этап в протеомных исследованиях. От эффективности выделения белков из исходного материала и очистки от небелковых примесей зависят качество получаемых после двумерного (2-D) электрофореза гелей и возможность их анализа. К методам выделения белков для протеомных исследований предъявляются особые требования по минимизации числа этапов работы, что необходимо для сохранности белков, а также по эффективному удалению примесей, которые могут негативно влиять на качество разделения и последующую оценку изменений в синтезе белков. Наша работа была посвящена поиску наиболее эффективного способа выделения общего пула белков из корней гороха посевного ( P. sativum L.), инокулированного ризобиями. Для этого мы сравнили три метода выделения белка: стандартный, предлагаемый компанией «Bio-Rad Laboratories» (США); метод, основанный на использовании фенола и ацетата аммония; метод с применением трихлоруксусной кислоты. В работе использовали растения гороха сорта Frisson, для инокуляции применяли штамм Rhizobium leguminosarum bv. viciae CIAM1026. После выделения белков из корней проростков гороха, зараженных ризобиями (1 сут после инокуляции), было показано, что лучший результат достигается при использовании фенола с последующим осаждением белков ацетатом аммония. Гели анализировали на наличие примесей, затрудняющих поиск различающихся белковых продуктов, эффективность выделения общего белка и видимые следы деградации белков. Для выделенных белков был проведен дифференциальный 2-D электрофорез с использованием флуоресцентных меток цианин-2 (Cy2) и цианин-5 (Cy5), основанный на изоэлектрическом фокусировании белков с помощью стрипов с диапазоном рН 3-10 и последующим разделением в полиакриламидном геле (ПААГ). Установлено, что при выделении белков с помощью фенола и ацетата аммония удалось получить достаточно представительные протеомы корней проростков гороха. Дифференциальный 2-D электрофорез позволил выявить различия между контрольным вариантом (неинокулированные корни) и вариантом, полученным после инокуляции ризобиями (инокулированные корни). Разработанный метод может быть использован в дальнейшем для протеомных исследований на растениях гороха.