Отдаленные последствия цитостатических воздействий на зародышевые клетки тестикулярной ткани (экспериментальное исследование)

Цитостатические препараты, первые разработки которых относятся к середине прошлого века, принимают большинство пациентов онкологических клиник [1, 2]. Позднее у ряда из этих препаратов наряду с противоопухолевыми выявлены еще и противовоспалительные свойства, что нашло широкое применение в терапии аутоиммунных воспалительных заболеваний [3]. В настоящее время опубликованы клинические обзоры, посвященные оценке влияния цитостатических препаратов на потомство [4, 5]. Прогноз при ряде онкологических заболеваний существенно улучшился, что позволяет ориентироваться не только на выживаемость, но и на качество жизни пациентов [6]. Эффективное использование цитостатиков в ревматологической практике послужило еще одним фактором для изучения репродуктивной токсичности и влияния этих препаратов на потомство [7].

Известно, что в силу низкой избирательности цитостатические препараты угнетают сперматогенез, что может лишить мужчин возможности иметь потомство. Однако далеко не все из них вызывают необратимую инфертильность [8, 9]. Клинические наблюдения свидетельствуют о том, что воспроизводящая способность восстанавливается в 75 % [10]. Улучшение прогноза заболевания, молодой возраст, отсутствие детей служат побудительным моментом для принятия решения о планировании деторождения [11]. Сохранение способности к зачатию – необходимое, но не достаточное условие для реализации детородной функции. Не менее важным является генетическая и эпигенетическая полноценность гамет [12]. Цитостатики в силу механизма их действия заведомо генотоксичны. Несмотря на то, что структурные изменения ДНК сперматозоидов могут репарироваться ооцитом после оплодотворения [13], часть из них сохраняется и может вызвать негативные последствия для потомства [14]. Цитостатические воздействия вызывают не только структурные повреждения ДНК, но и приводят к эпимутациям в зародышевых клетках, прежде всего, к аберрантным схемам метилирования ДНК. Большая часть метилированных ДНК при оплодотворении нивелируется, но оставшиеся могут передаваться следующему поколению и инициировать в дальнейшем эпигенетически трансгенерационные заболевания [15, 16]. Эпигенетические изменения, переносимые оплодотворяющим сперматозоидом, важны для множества физиологических и патологических процессов, которые оказывают влияние на потомство на протяжении всей жизни [17].

Обеспокоенность по поводу потенциальной возможности передачи повреждения зародышевой линии тестикулярной ткани потомству инициировала проведение крупномасштабных клинических исследований, направленных на изучение состояния потомства мужчин, перенесших цитостатическое воздействие [4, 5]. Авторы, акцентируя свое внимание на фенотипических проявлениях мутагенных эффектов, описывают случаи мертворождения, внешних аномалий развития. Результаты этих исследований носят противоречивый характер. Часть авторов не обнаруживает увеличения риска генетических аномалий, перинатальной смерти, низкой массы тела, другие настаивают на обратном [4, 5, 11]. Противоречивость информации связывают с тем, что исследуемые выборки нельзя считать репрезентативными. Пациенты получают разные схемы химиотерапии, существенно варьирует продолжительность лечения, решение о деторождении принимается в различные сроки после приема препаратов. В ряде случаев химиотерапия сочетается с лучевыми воздействиями [5, 11]. В экспериментальных исследованиях выявлены нежелательные последствия для потомства при зачатии в ранние сроки после введения препаратов. Эти сроки соответствуют проявлению воздействия на зрелые и созревающие мужские половые клетки [18]. В связи с этим деторождение не рекомендуется планировать в течение 3 мес после химиотерапии. Этот срок определяется продолжительностью цикла сперматогенеза. В литературе отсутствует информация о том периоде времени, при котором повреждающих эффектов на зародышевые клетки не выявляется [5, 7, 11]. Между тем решение о деторождении принимается чаще всего пациентами, находящимися в состоянии длительной полной ремиссии, т. е. в отдаленные сроки после химиотерапии [11, 18]. С учетом длительности отдельных стадий сперматогенеза это соответствует проявлению воздействия на стволовые сперматогониальные клетки (ССК) [18]. Для прогнозирования состояния потомства в таких случаях важной является информация о наличии генетической и эпигенетической целостности стволовых сперматогониальных клеток [19]. Известно, что чувствительность ССК к генотоксикантам ниже, чем у соматических клеток, т. к. они обладают более надежной системой репарации ДНК [20]. Однако и они не являются полностью защищенными от мутагенных воздействий. Более того, установлено, что мутации, возникающие в ССК, могут закрепляться в популяции стволовых клеток, с течением времени выявляться в сперматозоидах и передаваться потомству [20]. Показано, что ССК могут характеризоваться геномной нестабильностью [21]. Исследованиями последних лет установлено также, что ССК чувствительны к факторам, оказывающим влияние на эпигеном [12, 22]. Риск последствий цитостатической химиотерапии для потомства при воздействии на ССК является малоизученным, а оценка противоречивой [5, 11, 18]. В то же время потребность в информации такого плана возрастает [1]. Сегодня обоснована актуальность изучения индивидуальных особенностей, состояния потомства после воздействия на гоноциты конкретного препарата [23].

Целью исследования явилась оценка постнатального развития потомства крыс-самцов, получавших цитостатические препараты разных групп, при скрещивании с интактными самками в сроки, соответствующие проявлению воздействия на ССК.

Материал и методы

Эксперименты проведены на 140 крысах-самцах сток Вистар (возраст – 2,5 мес), 70 из которых составили контрольную группу интактных животных. Все животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга, Томск. Животных содержали в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). Крысы до и в период эксперимента находились в виварии при t_B03g =20 ^ 22 °C, влажности – не более 50 %; объем возд^. ухообмена (вытяжка:приток) – 8:10; в световом режиме день-ночь; в стандартных пластиковых клетках (не более 5 особей в каждой) с мелкой древесной стружкой; на стандартном рационе – гранулированный корм ПК121-10 (ГОСТ Р50258-92).

Животным экспериментальных групп (n=10 в каждой) вводили однократно внутривенно в максимально переносимой дозе препараты: Вепезид (этопозид, Теvа, Израиль), Иринотекан (Кампто, Rhone-Poulens, Великобритания), Карбоплатин (кемокарб, «Дабур Индия Лтд», Индия), Паклитаксел (митотакс, Dr. Reddy`s, Индия), Платидиам («Lachema», Чехия), Фарморубицин (Farmitalia, Carlo Erba), Метотрексат МТХ (Ebeve Pharma, Австрия). Одной их групп животных вводили Метотрексат МТХ (Ebeve Pharma, Австрия) подкожно, четырехкратно, с недельными интервалами в дозе 1 мг/кг. Выбор дозы и режима введения этого лекарственного средства обусловлен тем, что в клинической практике он наиболее часто используется курсами в низких дозах.

Животные скрещивались с интактными крысами-самками через 3 и 6 мес после их введения

(сроки, соответствующие проявлению последствий воздействия на ССК). Спаривание регистрировали с помощью вагинальных мазков. На 18-й день беременности крыс-самок рассаживали по одной в клетки для подготовки к родам. Регистрировали день родов, число крысят в помете, проводили макроскопический осмотр родившихся крысят. На 25–30-й день жизни от крысят убирали матерей. При изучении состояния потомства в постнатальном периоде использовались тесты и системы, рекомендованные центром экспертизы средств медицинского применения [24]. В первый день жизни определяли массу тела крысят, на 4, 7, 14 и 21-й дни – индекс выживаемости. В течение 2 мес следили за физическим развитием потомства (определяли сроки отлипания ушной раковины, появления первичного волосяного покрова, прорезания резцов, открытия глаз, опускания семенников, открытия влагалища). На 5-й, 60-й дни жизни оценивали функциональное состояние центральной нервной системы по тестам «избегание обрыва», «условный рефлекс пассивного избегания» (УРПИ).

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием U-критерия Манна–Уитни и углового преобразования Фишера. Различия считали значимыми при р≤0,05.

Результаты

У интактных крыс-самок, скрещенных с самцами, получавшими различные виды цитостатического воздействия, рождение потомства наблюдалось почти во всех случаях. Исключение составили крысы-самки, ссаженные с животными, получавшими антрациклиновый антибиотик за 3 мес до зачатия. При макроскопическом осмотре потомства (n=1640) было выявлено 2 особи с грубыми внешними аномалиями развития. Так, у одной из них (самка ‒ потомство крыс-самцов, получавших П) наблюдалась аплазия хвостового отдела. В потомстве крыс-самцов, получавших Ф, у одного животного обнаружена мозговая грыжа. Родившиеся животные контрольных и экспериментальных групп не отличались друг от друга по индексам выживаемости (табл. 1). Масса тела при рождении почти во всех группах животных оказалась сходной. Исключение составило потомство животных, получавших Пл. Этот показатель у крысят-самцов этой группы превосходил контрольные значения на 40 % (р≤ 0,05), у крысят-самок – на 55 % (р≤ 0,05). Задержка физического развития была выявлена в 2 группах – в потомстве крыс-самцов, которым вводили П (первая группа) и М (вторая группа). У 68 и 95,8 % (срок скрещивания 3 и 6 мес) крысят

Таблица/Table

Оценка состояния потомства интактных крыс-самок и крыс-самцов, скрещенных через 3 и 6 мес после введения цитостатических препаратов, в постнатальном периоде развития

Assessment of the state of the offspring of intact female and male rats copulated 3 and 6 months after the administration of cytostatic drugs in the postnatal period of development

	Э/E		И/I		М/M		П/P		K/С		Пл/Pl		Ф, 6
Показатели/	3	6	3	6	3	6	3	6	3	6	3	6
Parameters	мес/	мес/	мес/	мес/	мес/	мес/	мес/	мес/	мес/	мес/	мес/	мес/	F, 6 mth
	3	6	3	6	3	6	3	6	3	6	3	6
	mth	mth	mth	mth	mth	mth	mth	mth	mth	mth	mth	mth

Внешние аномалии развития/ External anomalies of development

+–––––+

Масса тела крысят при рождении/ Body weight of rat pups at birth

Индекс выживаемости/

Survival index

Физическое развитие/ Physical development

+–++–––––

Мышечный тонус/ Muscle tone

+–––+–

Тест «избегание обрыва»/ Break avoidance test

+––+–+–––

Способность к обучению (тест УРПИ)/ +    +

Ability to learn (CRPI test)

+

+–+

Адаптивное поведение (тест Хандерсон)/ Adaptive behavior (Hunderson test)

++