Отходы от переработки дальневосточных дикоросов - перспективные источники пищевых антиоксидантов

различных ПФ антиоксидантов, способных инактивировать свободные радикалы, имеет целый ряд положительных эффектов на здоровье человека [10]. Ранее было показано, что растительные препараты, полученные нами из гребней (кисти, освобожденные от ягод) калины ( Viburnum sargentii ) и гребней винограда Амурского ( Vitis amurensis ), зарегистрированные соответственно под торговыми марками «Калифен» и «Диприм», обладают ярко выраженными гепатозащитными свойствами [1, 2] и содержат в своем составе многокомпонентный ПФ комплекс. В связи с тем, что в реализации биологической активности ПФ соединениями, включая гепатопротекторную [8], ведущую роль играет АА [16], целью данной работы явилась ее оценка у препаратов, полученных из отжима калины (гребни, косточки, кожица ягод) (ЭОК) и отжима винограда Амурского (ЭОВ). Косточки и кожица ягод были нами добавлены в состав экстрагируемого сырья, так как ранее было показано, что косточки и кожица ягод винограда характеризуются высоким содержанием ПФ [9].

Методы исследования. Экстракты из растительного сырья готовили на 40% этиловом спирте методом реперколяции. Выход препаратов составлял 1 л на 1 кг сырья. В полученных экстрактах определяли содержание экстрактивных веществ. Для выделения ПФ фракции 10 мл исходного экстракта упаривали на роторном испарителе (t<35oC), для удаления спирта и разводили дистиллированной водой до исходного объема. Затем образец наносили на экстракционную колонку ENVI C18 (Waters, USA) содержащую 10 г сорбента. Экстракционную колонку после нанесения образца элюировали 50 мл воды (рН=7) для удаления углеводов, органических кислот и других соединений, не сорбировавшихся на колонке. После просушивания колонки в токе азота, ПФ фракцию 20 мл этанола и использовали при дальнейшей работе. Суммарное содержание ПФ соединений в исходных экстрактах и выделенных фракциях определяли с помощью реактива Фолина-Чикалтео [3], используя в качестве стандарта галловую ки- слоту (ГК). Количественно содержание ПФ соединений выражали в мг-экв ГК.

Уровень АА полученных препаратов и их фракций оценивали:

• 1)    по способности восстанавливать органический катион радикал ABTS⁺ (2,2'-азинобис-3-этилбензотиазолин-6-сульфонат) [11]. АА оценивали по снижению величины абсорбции при длине волны 734 нм на спектрофотометре Unico 2800 (Unico, USA). Перед определением исходный раствор ABTS⁺ разводили этанолом до величины абсорбции 0,9 ± 0,02. Реакцию проводили непосредственно в кювете объемом 1 мл, куда помещали 1 мл разведенного раствора ABTS⁺ и замеряли величину поглощения А₇₃₄. После этого в кювету добавляли 10 мкл раствора растительного образца или модельного антиоксиданта сравнения (тролокса) в этаноле, тщательно перемешивали и замеряли поглощение ровно через 3 мин. Реакцию проводили при комнатной температуре ≅ 20^оС. Каждое измерение проводили не менее 3 раз.

• 2)    по способности предотвращать окислительную модификацию салициловой кислоты под действием гидроксил радикалов (ОН^-) [4] генерируемых в железо/аскорбатной модели [12]. Вкратце, реакционную смесь (200 µ М аскорбиновой кислоты, 4 µ М ЕДТА, 350 µ М салициловой кислоты, 2 µ М Fe³⁺, 100 µ л образца) объемом 1 мл инкубировали в течение 60 мин при 35^оС. Через 60 мин в инкубационной среде анализировали продукты окислительной модификации салициловой кислоты (2,3- и 2,5- дигидроксибензойные кислоты). Для этого аликвоту реакционной смеси объемом 100 мкл, помещали в бутылочку для автоматического устройства для ввода проб и анализировали методом ВЭЖХ [14]. Для анализа использовали колонку Сферисорб RP18 (150 х 3 мм), которую элюировали в изократном режиме. Подвижная фаза: 0,03 М лимонной кислоты и 0,03 М уксусной кислоты (рН=3,6); скорость элюирования 1,5 мл/мин.

АА оценивали по уменьшению площади пика, соответствующего дигидроксибензойным кислотам по сравнению с контролем, когда вместо образца в реакционную смесь добавляли 0,1 мл дистиллированной воды. За единицу АА принимали такое количество антиоксиданта, которое вызывало изменение оптической плотности А 734 или уменьшение площади пика, соответствующего продуктам окисления салициловой кислоты, равное таковому при действии 1 µ М тролокса (±-6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоксиль-ная кислота) (Sigma-Aldrich, USA), который представляет собой водорастворимый аналог витамина Е и является общепринятым модельным антиоксидантом. Для расчета величин АА в µ М-тролокса полученных фракций строили калибровочный график в диапазоне от 1,25-40 нМ тролокса для метода № 1 и от 1,25-20 нМ тролокса для метода №2. Значения величин Δ А 734 и Δ S в указанных диапазонах концентраций имели линейную зависимость от концентрации тролокса.

В качестве препарата сравнения был использован пикногенол (Stryka Botanicals, Switzerland), представляющий собой ПФ комплекс, выделенный из коры французской морской сосны ( Pinus Mari-tima ). Принимая во внимание паспортные данные о 95% содержании ПФ соединений, мы готовили раствор пикногенола с концентрацией 20 мг/мл, что примерно соответствовало содержанию суммарной полифенольной фракции в экстракте отжима калины и использовали его в качестве модельного комплекса полифенолов. Все измерения проводили не менее трех раз. Результаты выражали в виде М ± SEM.

Результаты и обсуждение . Максимальное количество полифенольных соединений (19,4 мг/мл) содержал ЭОК. Для ЭОВ этот показатель составил 16,58 мг/мл (табл. 1). Из полученных результатов следует, что от 91 до 95% хромофора, образующегося в реакции Фолина-Чикалтео, обусловлено ПФ соединениями. Из соединений нефенольной природы, способных вызывать восстановление иона молибдата, наиболее вероятным представляется наличие аскорбиновой кислоты, присутствующей, как правило, в большинстве растительных препаратов. Принимая во внимание наличие одной активной гидроксильной группы в молекуле аскорбиновой кислоты с молекулярной величиной абсорбции равной 17,500, ее содержание в исходных растительных экстрактах можно оценить в пределах от 40 до 250 мкг/мл.

Таким образом, метод определения общих ПФ с реактивом Фолина-Чикалтео является достаточно точным для изучаемых экстрактов и, принимая во внимание низкое содержание сопутствующих реакционно-активных соединений (образование хромофора менее 10%), может применяться без дополнительной очистки экстрактов. Содержание суммарной ПФ фракции в изученных препаратах достигает 10,1-10,2% от суммы экстрактивных веществ (табл. 1), что является достаточно высоким показателем. Количественные характеристики пикногенола соответствуют паспортным данным (95% полифенолов).

Для оценки АА исходных экстрактов и выделенных из них ПФ фракций, были выбраны две модельные системы, позволяющие судить как об электронофорной (ABTS+), так и о протонофорной (OH-) активности исследуемых антиоксидантов. Из табл. 2 следует, что наибольшей активностью восстанавливать катион радикал ABTS+ обладает ЭОК, при этом более 91% активности ассоциировано с ПФ фракцией. Сходная картина наблюдается и с ЭОВ. Более 90% АА по отношению к кати-он-радикалу ABTS+ связано с ПФ фракцией. Следует отметить, что удельная АА (на 1 мг ПФ фракции) ЭОК по отношению к ABTS+ была на 15% выше, чем у ЭОВ. Можно предположить, что данный феномен может быть результатом различий в химическом строении отдельных соединений входящих в ПФ комплекс, которые у ЭОК вероятно являются более оптимальными с точки зрения проявления электронофорной активности.

Таблица 1. Содержание общих полифенолов в водно-спиртовых экстрактах (в мг-экв галловой кислоты), (М ± m)

Примечание : содержание различных веществ в мг/мл экстракта эквивалентно содержанию в мг на 1 г исходного сырья. ЭОВ – экстракт отжима винограда Амурского; ЭОК – экстракт отжима калины

Данные, полученные для пикногенола, показали, что 97% АА по отношению ABTS+ ассоциированы с ПФ фракцией. Удельная антирадикальная активность ПФ фракции пикногенола в первой модельной системе (ABTS+) составила 84% и 73% от таковой у ЭОВ и ЭОК соответственно. Полученные нами величины АА исследованных ПФ комплексов для системы с радикалом ABTS+ сравнимы с опубликованными данными других авторов для ПФ комплексов из винограда [15].

Гидроксильный радикал (ГР) является самым реакционным и токсичным из всех активных форм кислорода, образующихся в организме человека [6]. Благодаря своей экстремально высокой реакционной способности и малому размеру, ГР способен передвигаться в среде с достаточно высокой скоростью и атаковать практически любую молекулу в любой части ее углеродного скелета

• [5]. Атакуя молекулы липидов, ГР инициируют ПОЛ, вызывая массированное повреждение биологических мембран [5] и окислительную модификацию ЛПНП, являющуюся одним из основных факторов развития склеротических процессов в сосудах [7]. В связи со сказанным, способность антиоксиданта инактивировать ГР, является одним из важнейших показателей его активности. Активность ЭОК и ЭОВ инактивировать ГР была практически равной, при этом с ПФ фракцией было ассоциировано 88 и 76% АА, соответственно. Более высокая активность ПФ комплекса из ЭОК на 1 мл экстракта, очевидно, обусловлена большим содержанием ПФ. Удельная АА на 1 мг ПФ фракции в ЭОК и ЭОВ была выше, чем таковая у пикногенола и составила соответственно 121 и 113%.

Таблица 2. Антирадикальная активность изученных препаратов в модельных системах в µ М тролокса (M ± m)

Примечание: ЭОВ – экстракт отжима винограда Амурского ; ЭОК – экстракт отжима калины Саржента; ПФ – полифенольная.

Выводы: продукты переработки Дальневосточных дикороссов пищевого назначения, такие как виноград амурский (Vitis amurensis) и калина Cаржента (Viburnum sargentii) могут служить перспективным источником сырья для получения растительных фитопрепаратов, содержащих ПФ комплексы с высокой антиоксидантной активностью. Полученные препараты обладают как протонофорной, так и электронофорной активностью и способны инактивировать свободные радикалы, несущие как положительный заряд, так и неспаренный электрон. При этом уровень АА у ЭОК и ЭОВ в обеих моделях пропорционален содержанию в препаратах ПФ фракции, с которой ассоциировано от 76 до 90% АА. Удельная АА у ПФ фракции ЭОВ и ЭОК превышает таковую у пикногенола – коммерчески реализуемого антиоксиданта ПФ природы. Это позволяют обосновать возможность создания безотходной технологии, повышающей рациональность использования растительного сырья, путем использования отходов переработки калины и винограда для получения высокоактивных препаратов, обладающих высокой антиоксидантной активностью.