Овуляторная функция крыс в условиях блокады мелатониновых рецепторов

Репродуктивная функция самок млекопитающих находится под контролем гипоталамуса, регуляторная деятельность которого осуществляется посредством гормона мелатонина [1]. Основной эффект мелатонина заключается в торможении секреции тропных гормонов передней доли гипофиза и в модифицирующем влиянии на нейросекреторную активность гипоталамуса. Независимо от того, активно животное днем или ночью, максимальный уровень мелатонина наблюдается всегда во время темновой фазы естественного или искусственно созданного цикла чередования дня и ночи [11].

Известно, что введение лузиндола – антагониста мелатониновых рецепторов МТ1 и МТ2 значительно ослабляет эффекты экзогенного и эндогенного мелатонина [14], [16], [17]. Исходя из этого представляется интересным изучение функционирования репродуктивной системы самок млекопитающих в условиях угнетения мелатониновых сигнальных механизмов.

Целью данного исследования явилось изучение эстрального цикла самок крыс в условиях блокады мелатониновых рецепторов лузиндолом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования были проведены на 40 самках крыс Вистар собственной разводки, первоначально полученных из питомника лабораторных животных «Пущино» (научно-производственное подразделение Филиала Института биооргани-ческой химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова, Московская область). Животных содержали при температуре воздуха в помещении 22 ± 2 °С в клетках размером 40 × 60 × 20 см по 10 особей в каждой с обеспыленной подстилкой из древесной стружки. В помещении были соблюдены условия стандартного чередующегося режима освещения (12 ч. свет, 12 ч. темнота LD): люминесцентные лампы (освещенность 750 лк на уровне клеток) освещали помещение в течение 12 дневных часов, на ночь (12 ч.) свет отключали; окна в помещении отсутствовали.

Все крысы получали гранулированный корм (ГОСТ Р 50258-92 «Комбикорма полнорационные для лабораторных животных. Технические условия»: содержание протеина более 25 %, жиров 6–12 %, кальция и фосфора 1–1,4 %, лизина и метионина 0,7–1,5 %, микроэлементов и витаминов 3–4 %) и отстоянную водопроводную воду без ограничения.

Работа была выполнена с соблюдением международных принципов Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным, прин- ципов гуманности, изложенных в директиве Европейского Сообщества (2010/63/ЕU), «Био-этических правил проведения исследований на человеке и животных», «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных», «Санитарно-эпидемиологических требований к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)», «Руководства по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских технологиях» [12], [13].

В пятимесячном возрасте самки крыс были рандомизированно (по весу) разделены на две группы. Животные первой группы (n = 20; LD + luz) получали ежедневно 5 дней в неделю с питьевой водой в ночное время с 20:00 до 08:00 лузиндол (N-Acetyl-2-benzyl-tryptamine) фирмы «Bachem AG» (Швейцария) в концентрации 10 мг/л. Поилки, в которых находился лузиндол, были изготовлены из темного непрозрачного полимерного материала. Свежий раствор препарата готовили ежедневно. Вторая группа (n = 20; LD) в ночное время получала питьевую воду в том же объеме и явилась контрольной.

В возрасте три, шесть, девять, двенадцать и пятнадцать месяцев у животных ежедневно в течение двух недель брали влагалищные мазки для изучения эстральной функции. У грызунов содержимое влагалища в зависимости от фазы овуляторного цикла имело различный состав, который можно определить при микроскопировании. Весь овуляторный цикл крысы делился на следующие стадии: 1) диэструс, или стадия покоя; 2) проэструс, или стадия подготовки к течке; 3) эструс, или стадия течки; 4) метаэструс, или стадия после течки. В соответствии с данными фазами изменялся состав содержимого влагалища. Мазки готовили по общепринятой методике из влагалищного содержимого, полученного утром в одно и то же время посредством введения во влагалище крыс ватного тампона. Свежеприготовленные мазки без фиксации и окраски изучали под бинокулярным микроскопом при увеличении в 70 раз (об. 10, ок. 7) с опущенным конденсором микроскопа. Результаты исследования вагинального содержимого фиксировали в журнале. Проводили оценку следующих параметров: длительность эстрального цикла; соотношение фаз овуляторного цикла; относительное число коротких, средних и длинных циклов; процентное соотношение фаз эстрального цикла; относительное число животных с иррегулярными циклами [9].

Статистическую обработку цифрового материала проводили с использованием общеприня- тых методов вариационной статистики в среде программы EXCEL. Достоверность результатов оценивали по непараметрическому U-критерию Уилкоксона – Манна – Уитни и методом χ2. Достоверно различающимися признавали значения при р < 0,01 и р < 0,05; при 0,05 < р < 0,1 различия между средними имели тенденцию к достоверности [8].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

В физиологических условиях к возрасту 15–18 месяцев у крыс появляются признаки старения репродуктивной системы: короткие эстральные циклы исчезают, преобладают длинные овуляторные циклы (более 7 дней), снижается количество регулярных циклов, появляются иррегулярные циклы [3], [7].

В ходе наших исследований установлено, что в контрольной группе короткие циклы сохранялись и в зрелом возрасте, хотя их количество с возрастом достоверно снижалось с 54 % в 6 месяцев до 12 % к 15-месячному возрасту, причем уже в возрасте одного года количество коротких эстральных циклов было достоверно меньше (p < 0,05). На втором году жизни у самок контроля преобладали циклы средней продолжительности (достоверное увеличение наблюдали также с 12-месячного возраста). В опытной группе установлена аналогичная закономерность, но при этом через месяц приема лузиндола доля коротких циклов достоверно уменьшилась по сравнению с группой контроля и в возрасте 6 месяцев составила всего 14 %, а в 15-месячном возрасте короткие эстральные циклы у крыс дан- ной группы отсутствовали. Начиная с 6-месячного возраста в группе животных, получавших лузиндол, достоверно преобладали средние эстральные циклы. Различия исследуемых показателей контрольной и опытной групп начиная с возраста 6 месяцев являются достоверными (p < 0,05) (таблица). В возрасте одного года у самок, получавших лузиндол, преобладали эстральные циклы с длительностью более 7 дней, в дальнейшем происходило перераспределение эстральных циклов разной длительности за счет появления иррегулярных овуляторных циклов. Доля длинных циклов с 6-месячного возраста в группе LD + luz была достоверно выше по сравнению с опытной группой. К 15-месячному возрасту данный показатель возрос до 29 % в группе контроля и до 42 % в группе, получавшей лузин-дол. Установленные различия также являются достоверными (p < 0,05). Полученные результаты свидетельствуют о более быстром старении репродуктивной системы крыс, подвергавшихся блокаде мелатониновых рецепторов при действии лузиндола.

В трехмесячном возрасте длительность эстрального цикла у самок крыс составляла 3,7 ± 1,1 дня. В контрольной группе зафиксировано достоверное увеличение средней продолжительности овуляторного цикла к 12-месячному возрасту – 5,2 ± 1,2 дня (p < 0,05). В опытной группе длительность эстрального цикла уже в возрасте 6 месяцев была достоверно больше по сравнению с параметром, полученным в возрасте 3 месяцев, и составляла 5,9 ± 1,5 дня (p < 0,05). В последующие возрастные периоды данный

Возрастная динамика показателей эстральной функции у крыс

Возраст, мес.	Средняя продолжительность эстрального цикла, дни	Количество эстральных циклов разной длительности, %			Соотношение фаз овуляторного цикла, %		Число исследованных эстральных циклов, %
		Короткие	Средние	Длинные	Эструсы	Диэструсы	Нормальные циклы	Иррегулярные циклы

Стандартное освещение (LD)

6	4,8±1,4	54 в	43 в	3 в	37	63	100	0
9	4,9±1,9	47 в	43 в	10 б, в	58 б	42 б	93 в	3 в
12	5,2±1,2 а	28 б, в	64 б, в	8 в	55 б	45 б	89 б, в	11 б, в
15	6,1±1,5 а	12 б, в	59 б	29 б, в	45	55	81 б, в	19 б, в

Стандартное освещение + лузиндол (LD + luz)

6	5,9 ± 1,5 а	14 в	68 в	18 в	32	68	97	3
9	6,6 ± 2,0 а	9 в	64 в	27 в	64 б	36 б	88 б, в	12 б, в
12	7,2 ± 1,8 а	7 в	39 б, в	54 б, в	56 б	44 б	69 б, в	31 б, в
15	7,3 ± 1,8 а	0 б, в	58	42 б, в	41	59	67 б, в	33 б, в

Примечание . ^а р < 0,05 – различия в группе с показателем в трехмесячном возрасте достоверны (критерий Уилкоксо-на – Манна – Уитни); ^б р < 0,05 – различия в группе с показателем в шестимесячном возрасте достоверны (метод χ²); ^в р < 0,05 – различия с показателем в группе LD в соответствующем месяце достоверны (метод χ²).

Рис. 1. Продолжительность эстрального цикла у самок крыс. р < 0,05 – различия в группе с показателем в трехмесячном возрасте достоверны (критерий Уилкоксона – Манна – Уитни); LD – стандартное освещение; LD + luz – лузиндол

показатель достоверно увеличивался до 7,3 ± 1,8 дня в возрасте 15 месяцев (рис. 1). В предыдущих исследованиях показано достоверное удлинение эстрального цикла с 8-месячного возраста у крыс-самок, находящихся в период прогрессивного роста в условиях естественной повышенной освещенности (белые ночи) или в условиях постоянного искусственного освещения [5], [6], [7]. Содержание животных в условиях постоянного или естественного освещения в период белых ночей приводило к нарушению работы шишковидной железы и угнетению продукции и секреции мелатонина – основного гормона эпифиза [1], что являлось причиной ранних возрастных изменений в репродуктивной системе крыс. В нашей работе применение лузиндола, блокирующего мелатониновые рецепторы, соответствовало эффектам, возникающим при физиологической эпифизэктомии, приводящей к угнетению выработки мелатонина. В других исследованиях показано, что искусственное увеличение продолжительности светового периода в течение дня даже на 2–4 часа, при котором не происходило достаточной секреции мелатонина, приводило у грызунов к увеличению продолжительности эстрального цикла, а в некоторых случаях – к его нарушению. Если воздействие света на крыс увеличить до 24 часов в сутки, у большинства из них в короткие сроки развивался синдром персистирующего (постоянного) эструса [2], [3]. В наших исследованиях применение лузиндола приводило у крыс-самок к более раннему увеличению средней продолжительности овуляторного цикла с возраста 9 месяцев, таким образом, показатели, полученные при помощи фармакологической блокады мелатониновых рецепторов, соответствовали параметрам при так называемой физиологической пинеалэктомии, которая достигается постоянным освещением животных [5], [6], [7].

При изучении соотношения фаз овуляторных циклов установлена тенденция к уменьшению доли диэструсов и увеличению доли эструсов с возрастом в обеих группах (см. табл.). У крыс группы LD доля диэструсов в 6 месяцев составила 63 %, в 15 месяцев – 55 %, у крыс группы LD + luz аналогичный показатель равнялся 68 % в возрасте 6 месяцев и 59 % в возрасте 15 месяцев. Соответственно, доля эструсов у крыс-самок контрольной группы в 6-месячном возрасте составляла 37 %, а у крыс-самок опытной группы – 32 %. С возрастом в контрольной группе количество эструсов изменялось незначительно, в то время как в опытной группе количество эструсов увеличилось в два раза в возрасте 9 месяцев, затем уменьшилось к 15 месяцам и составило 41 % от общего количества фаз овуляторного цикла. Достоверных различий данных показателей между группами не установлено.

С возрастом у животных было зафиксировано появление иррегулярных циклов. В группе контроля данный показатель впервые был отмечен в 9 месяцев и составил 3 % от общего количества. Достоверное увеличение доли иррегулярных циклов наблюдалось с 12-месячного возраста. В опытной группе данный показатель зафиксирован раньше – в возрасте 6 месяцев. Достоверное увеличение доли иррегулярных циклов отмечено с 9 месяцев. В 15 месяцев у животных опытной группы зафиксировано максимальное количество иррегулярных циклов – 33 %, у животных контрольной группы – 19 %. Достоверные различия между группами наблюдались с возраста 9 месяцев (рис. 2). В исследованиях Д. А. Батурина, И. Н. Алимовой и др. у мышей HER-2/neu, содержавшихся с 2 месяцев при постоянном освещении, в возрасте 9 месяцев иррегулярные циклы обнаруживали у 76 % самок, в то время как у животных, содержавшихся в стандартном режиме, у 50 % самок [4]. В других исследованиях при содержании крыс в условиях постоянного и характерного для Карелии естественного освещения с периодом белых ночей отмечено появление иррегулярных циклов в молодом (5-месячном) возрасте. К 23-месячному возрасту количество иррегу-

Рис. 2. Количество иррегулярных циклов (%) у самок крыс. * р < 0,05 – различия с показателем в группе LD в соответствующем месяце достоверны (метод χ 2 ). Обозначения, как на рис. 1

лярных циклов у животных этих групп возросло до 80 и 64 % соответственно [5]. По данным Д. В. Клочкова и Д. К. Беляева, продолжительное освещение с 2-месячного возраста крыс Вистар в течение 1, 2 или 6 месяцев приводило к появлению персистирующего эструса у 24, 61 и 100 % животных соответственно [10]. В другом исследовании у 100 % крыс Вистар отмечали постоянный эструс при содержании с 4-месячного возраста в течение 3 месяцев в условиях постоянного освещения [15]. В отличие от данных экспериментов в наших исследованиях не установлено наличие персистирующего эструса в опытной группе, что косвенно указывает на различие в ответах репродуктивной системы на снижение выработки мелатонина или блокаду мелатониновых рецепторов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в ходе десятимесячного исследования эстральной функции крыс-самок, получающих с возраста 5 месяцев лузиндол, выявлены ранние возрастные изменения репродуктивной системы по сравнению с группой контроля. У крыс опытной группы зафиксировано достоверное более раннее увеличение продолжительности овуляторного цикла с 9-месячного возраста, снижение количества регулярных циклов, появление иррегулярных циклов, уменьшение количества коротких и увеличение количества длинных эстральных циклов через 1 месяц приема лузиндола. Вероятно, применение лузиндола, результатом действия которого является блокада мелатониновых рецепторов, приводило к более выраженным возрастным изменениям репродуктивной системы. По всей видимости, блокада мелатониновых рецепторов, находящихся в гипофизе и гипоталамусе, могла привести к усилению секреции гонадолиберинов и гонадотропинов, в результате чего активация роста и развития фолликулов в яичниках способствовала более длительному выделению эстрогенов и изменению фаз овуляторного цикла. Несмотря на различные механизмы развития недостаточности мелатонинергической системы (снижение выработки мелатонина при воздействии постоянного освещения [5], [6], [7] и блокада мелатониновых рецепторов при применении лузиндола), эффекты действия на овуляторную функцию схожи: нарушения, возникающие в работе репродуктивной системы, характеризуются более быстрыми возрастными изменениями эстрального цикла. При фармакологической блокаде мелатониновых рецепторов не зафиксировано ни одного животного с синдромом персистирующего эструса, что косвенно указывает на наличие безрецепторной гормональной регуляции мелатонина через систему половых гормонов.

* Работа выполнена в рамках Программы стратегического развития ПетрГУ на 2012–2016 гг. «Университетский комплекс ПетрГУ в научно-образовательном пространстве Европейского Севера: стратегия инновационного развития», «УМНИК – 2013» и гранта РФФИ № 15-34-50841.

RATS’ OVULATORY FUNCTION UNDER MELATONIN RECEPTORS’ BLOCKADE