Оздоровление микрорастений трех культурных видов картофеля (Solanum tuberosum L., S. phureja Juz. & Buk. и S. stenotomum Juz. & Buk.) от вирусов методом комбинированной термо-химиотерапии

Коллекция картофеля, собранная во Всероссийском институте генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова (ВИР), — одна из крупнейших и старейших в мире. Она насчитывает около 8500 образцов селекционных сортов, диких и культурных видов, а также межвидовых гибридов (1). Образцы картофеля полевых коллекций, длительно репродуцируемые клубнями, могут накапливать вирусные инфекции. Известно около 40 вирусов, поражающих картофель, из них наиболее вредоносны Y-вирус картофеля (YВК), вирус скручивания листьев картофеля (ВСЛК), M-вирус

Статья подготовлена при поддержке Программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2013-2020 годы. Завершающий этап работы выполнен при частичной поддержке КЦП РФ «Научное обеспечение деятельности по созданию отечественного посевного фонда, средств защиты растений в целях производства российскими производителями конкурентоспособной сельскохозяйственной продукции, а также по созданию технологий производства (выращивания) и хранения такой продукции на 2016-2025 годы» (по приоритетному направлению «Картофелеводство»).

картофеля (MВК), S-вирус картофеля (SВК), X-вирус картофеля (XВК), A-вирус картофеля (AВК) (2-4). На территории России и стран СНГ чаще всего встречаются YВК, ВСЛК, XВК, SВК, MВК, реже выявляются F-вирус картофеля и AВК (5). В полевых условиях вирусы передаются главным образом насекомыми-переносчиками (преимущественно тлей), а также контактным способом (3).

Для оздоровления растений используют культуру апикальных меристем, химио-, термо-, крио- и электротерапию, а также разные сочетания этих методов (комплексная, или комбинированная, терапия). Метод оздоровления в культуре апикальных меристем, который был разработан одним из первых (6, 7), относительно малозатратен и до сих пор широко применяется. Однако для оздоровления растений в больших коллекциях, насчитывающих тысячи образцов, он становится менее востребованным из-за трудоемкости и в связи с появлением более эффективных комбинированных подходов. При криотерапии в жидком азоте (-196 °С) только клетки меристем, потенциально свободные от вирусов, сохраняют жизнеспособность, а вне меристемной зоны гидратированные клетки гибнут (8). Метод электротерапии основан на пропускании электрического тока через растительные ткани, в результате чего происходит деградация вирусного нуклеопротеина и патоген утрачивает вирулентность (9, 10).

Термотерапия in vivo и in vitro растений основана на снижении титра вирусов в зараженных тканях вследствие нарушения синтеза вирусных РНК при повышенных температурах — 36-40 °С (12). Способ менее эффективен в отношении сферических вирусов (4), поэтому при смешанных инфекциях его рекомендуют сочетать с другими технологиями. Химиотерапия основана на обработке инфицированных растений веществами с противовирусной активностью. К ним относятся ингибиторы синтеза вирусных нуклеиновых кислот — тилофорин и его производные, аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований, в том числе рибавирин, и др. (1113), а также РНКаза (14), интерферон (15), стимуляторы роста (16) и фенольные соединения, в частности салициловая кислота (17). Наиболее часто для химиотерапии растений картофеля in vitro применяется рибавирин — синтетический аналог гуанозина (1-бета-D-рибофуранозил-1Н-1,2,4-триазол-3-карбоксамид), но следует помнить, что низкие дозы препарата малоэффективны (11), а в высоких он угнетает развитие растений (8). Оптимальными считаются концентрации 30-50 мг/л (11-13).

В крупных центрах генетических ресурсов растений, таких как International Potato Centre (CIP, Перу) и Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK, Германия), для оздоровления коллекционных образцов картофеля используют схемы термо- и химиотерапии, различающиеся числом и продолжительностью этапов, а также комбинированную терапию, которая предусматривает разные сочетания этих методов (18-21). Частота элиминации вирусов может дополнительно повышаться при использовании культуры апикальной меристемы совместно с различными вариантами комбинированной терапии — термотерапией (22, 23), химиотерапией (25, 26) и термо-химиотерапией (12, 26, 27).

Отметим, что приемы антивирусной терапии неодинаковы по эффективности, а в ряде случаев одни и те же подходы в разных лабораториях дают противоречивые результаты. Кроме того, большинство исследований выполнены на единичных сортах или их ограниченном числе, поэтому не известно, насколько предлагаемые методики применимы для больших коллекций. Таким образом, разработка способов оздоровления расте-96

ний картофеля от вирусных инфекций остается крайне актуальной.

Взяв за основу протоколы термо- и химиотерапии, а также комплексной терапии ведущих генбанков картофеля (CIP и IPK), мы модифицировали схему оздоровления для больших выборок генетически разнородных образцов картофеля, в растениях которых были выявлены смешанные вирусные инфекции в различных сочетаниях. От протоколов IPK предложенная нами модификация отличается одновременным, а не последовательным применением повышенной температуры (37 °С) и рибавирина, а от схемы, используемой в CIP, — меньшим числом этапов (21).

Цель работы — сравнив известные протоколы, разработать и верифицировать схему комплексной антивирусной химио-термотерапии для оздоровления растений картофеля in vitro.

Методика . Материалом для исследований послужило 91 растение 85 образцов трех южно-американских культурных видов (аборигенных сортов) картофеля: Solanum phureja (18 образцов), S. stenotomum (26 образцов), S. tuberosum ssp. andigenum (= S. andigenum ) (23 образца), S. tuberosum ssp. tuberosum (= S. tuberosum ) (18 образцов) из коллекции ВИР. В статье указаны названия видов согласно таксономической системе J. Hawkes (1990) (28), которая в настоящее время используется наиболее широко; в скобках приведены обозначения, принятые в коллекции ВИР, которая структурирована по С.М. Букасову (1978) (29). Изучаемые образцы, которые представляют собой экспедиционные сборы разных лет, впоследствии длительное время репродуцировались в полевой коллекции.

Полевые растения анализировали на присутствие MВК, YВК, SВК, ВСЛК и XВК методом иммуноферментного анализа, применяя наборы и рабочий протокол фирмы «Agdia, Inc.», США) (данные не представлены). По результатам иммуноферментного анализа отбирали клоны среди растений полевой коллекции. Для сохранения вирусной инфекции эти клоны вводили в культуру in vitro с использованием апексов крупного (2-4 мм) размера (30). Полученные микрорастения сохраняли как клоновую коллекцию.

Препараты тотальной РНК (включает РНК вирусов) получали из нижних листьев развитых пробирочных растений согласно описанию (31), используя коммерческий набор для выделения на магнитных частицах, покрытых SiO 2 («Силекс», Россия). Препараты хранили при -70 °С. Обратную транскрипцию проводили при помощи набора «Синтез первой цепи кДНК (рендом)» («Силекс», Россия) в соответствии с прилагаемым протоколом (32). В набор входит смесь случайных гексануклеотидных праймеров, позволяющих одновременно получить кДНК для всех вирусных РНК и для РНК гена тубулина (контроль успешного синтеза матрицы). Специфичные праймеры (синтезированы в компании «Евроген», Россия) и режимы амплификации при выявлении вирусов YBK, MBK, XBK, SBK и ВСЛК в ПЦР описаны в литературе (33-36). Эффективность матрицы в ПЦР контролировали с помощью праймеров, специфичных для гена белка тубулина (36). Отрицательным контролем служили пробы без РНК. ПЦР выполняли на амплификаторе Mastercycler nexus gradient («Ep-pendorf», Германия). Для повышения специфичности ПЦР используемые программы предусматривали функцию TOUCHDOWN: исходно температура отжига праймеров устанавливалась на 5 °С выше необходимой и затем в каждом из пяти циклов амплификации понижалась на 1 °С. ПЦР-продукты разделяли при помощи электрофореза в 2,5 % агарозных гелях, окрашивали бромистым этидием и визуализировали в УФ-свете.

Перед началом экспериментов по оздоровлению каждый клон был протестирован на присутствие вирусов методом ОТ-ПЦР. Оздоровление микрорастений проводили модифицированным нами методом комбинированной термо-химиотерапии. При этом использовали питательную среду Мурасиге-Скуга (MS) без гормонов (30), содержащую антивирусный препарат рибавирин (30 мг/л). Комбинированная терапия включала три этапа продолжительностью 4 нед каждый, на которых растения подвергались воздействию рибавирина при повышенных температурах (37 °С), после чего их выдерживали на среде с рибавирином при 26 °С в течение 1 мес.

Статистическую обработку данных проводили, используя t- критерий Стьюдента при уровне значимости р < 0,05.

Результаты . Мы проанализировали известные методы оздоровления растений от вирусов (табл. 1), на основании чего была предложена модифицированная схема антивирусной терапии in vitro (рис. 1) с применением ОТ-ПЦР для выявления инфицированности. Эффективность этой схемы в отношении наиболее распространенных вирусных патогенов картофеля контролировали на выборке из представителей нескольких видов Solanum , используя праймеры, специфичные к различным участкам геномов соответствующих вирусов (табл. 2).

1.    Эффективность различных методов оздоровления растений культурных видов картофеля от вирусных инфекций

ХВК          YВК       ВСЛК       SВК        МВК

Культура апикальных меристем

+б (22)	+а (37)             ++ (8)             ++а (23)	+а (23)
++а (23)	++ (8) Простая терапия Обработка рибавирином
+а (14, 38)	- а (11)                 - а (11)                +а (11, 14)	+а (14)
++а (11)	+а (14, 38)                              +++а (23, 38)	+в (12)
	+в (12)	++а (23)
	++а (8, 16) Обработка РНКазой	++++а (11)
+++а (39, 40)	- а (11)               +а (39, 40)          +а (39, 40) +а (40) Термотерапия	+а (39, 40)
++а (22, 23)	+а (16)              ++а (8)               - а (8)
+++а (41)	++а (8, 37)                                +а (23) Криотерапия
++б (22)	++++а (8)        ++++а (8) Комплексная терапия Химио- и термотерапия
++++а (11, 23, 28, 41)	- а (11, 23)            - а (11, 23)           ++а (23)	++а (23)
	++а (11, 17)        ++а (17)            ++++а (11, 38) Термотерапия и культура меристем	+++а (11)
++в (22)	++++а (8, 42)      ++++а (8, 42)     ++а (24)
++++а (23)	++++а (23, 42) Химиотерапия и культура меристем
++++а (25)	++а, в (26)           ++а, в (26)           +++а (25)
++++а, в (26)	++++а, в (26) Термо-, химиотерапия и культура меристем
+++а (27)	+++а (27)         +++а (27)         +++а (27) ++++а (37) Термо-, химио-, электротерапия и культура меристем
+++а (9)	+++а (10)         ++++а, в (26)

++++в (12)

П р и м еч а ни е. ХВК, YВК, SВК, MВК — соответственно X-, Y-, S- и M- вирусы картофеля, ВСКЛ — вирус скручивания листьев картофеля; « - » — отсутствие эффекта оздоровления; «+» — до 40 % безвирус-ных растений, «++» — от 41 до 60 % безвирусных растений, «+++» — от 61 до 89 % безвирусных растений, «++++» — от 90 до 98 % безвирусных растений. В скобках указаны цитируемые ссылки литературы. Тестирование методом иммуноферментного анализа (^а), в ПЦР с обратной транскрипцией (^б), с помощью растений-индикаторов или электронной микроскопии (^в). Пропуски означают отсутствие данных.

По результатам иммуноферментного анализа исходных растений из полевой коллекции (данные не приведены) и ОТ-ПЦР-анализа микрорастений, полученных после введения в культуру in vitro тех же клонов, весь материал был в разной степени поражен вирусами (рис. 2, А). Простые инфекции выявили у 25,3 % растений, однако у большинства отобранных для оздоровления клонов наблюдали смешанные инфекции с одновременным присутствием нескольких видов вирусов в разных сочетаниях, причем максимальное число (пять вирусов) обнаружили у образцов S. tuberosum ssp. tuberosum (см. рис. 2, А).

• 1.    Тестирование микрорастений методом ОТ-ПЦР на наличие вирусов

• 2.    Микроразмножение инфицированных in vitro растений

• 3.    Комплексная химио- и термотерапия:

  • 3.1.    черенкование микрорастений — для каждого генотипа на среду Мурасиге-Скуга (MS) без гормонов высаживают 10-20 безлиственных черенков (1-21 междоузлия), выдерживают при 26 ° С в течение 1 сут и далее культивируют при 37 ° С в течение 4 нед

  • 3.2.    получение безлиственных черенков от растений, прошедших этап 3.1, — микрораcтения культивируют на среде MS с добавлением рибавирина (30 мг/л) при 20 ° С в течение 2-3 сут, затем при 37 ° С в течение 4 нед

  • 3.3.    получение безлиственных черенков от растений, прошедших этап 3.2, — микрорастения культивируют на среде MS с добавлением рибавирина (30 мг/л) при 20 ° С в течение 2-3 сут, затем при 37 ° С в течение 4 нед

  • 3.4.    получение безлиственных черенков от растений, прошедших этап 3.3, — черенки выдерживают при 26 ° С в течение 1 сут, затем микрорастения культивируют на среде MS с добавлением рибавирина (30 мг/л) при 20 ° С в течение 4 нед

  • 3.5.    перенос микрорастений на среду MS без гормонов, культивирование при 20 ° С в течение 2 мес

• 4.    Выделение РНК и тестирование микрорастений методом ОТ-ПЦР на наличие вирусов

• 5.    Микроразмножение оздоровленного материала

2. Праймеры, использованные в работе при тестировании на наличие вирусов

Амлифицируемая РНК

Пара паймеров     Последовательность

| T, °С

Ссылка

X-вирус картофеля (ХВК)

PVX1-f

PVX1-r

AGGCCACAGGGTCGACTAC

TTGTTGTTCCAGTGATACGACC

57

(33)

Y-вирус картофеля (YВК)

PVY1-f

PVY1-r

ACGTCCAAAATGAGAATGCC TGGTGTTCGTGATGTGACCT

53

(33)

Вирус скручивания листьев картофеля (ВСЛК)

PLRV1-f

PLRV1-r

CGCGCTAACAGAGTTCAGCC GCAATGGGGGTCCAACTCAT

58

(33)

S-вирус картофеля (SВК)

PVS-f

PVS-r

TGGCGAACACCGAGCAAATG

ATGATCGAGTCCAAGGGCACT

57

(35)

M-вирус картофеля (MВК)

PVM4

PVM3

ACATCTGAGGACATGATGCGC TGAGCTCGGGACCATTCAAC

59

(34)

Контроль обратной транскрипции (ОТ)

tubul-f tubul-r

ATGTTCAGGCGCAAGGCTT TCTGCAACCGGGTCATTCAT

54

(36)

Рис. 1. Модифицированная схема оздоровления микрорастений культурных видов картофеля от вирусных инфекций на основе комплексной термо-химиотерапии. ОТ-ПЦР — ПЦР с обратной транскрипцией.

Проведенная комбинированная терапия в целом значительно снизила степень вирусного поражения микрорастений (cм. рис. 2, Б, рис. 3). По результатам ОТ-ПЦР анализа 42 клона (46 %) от числа прошедших процедуру оздоровления оказались полностью свободными от тестируемых вирусов, у 44 % клонов произошла элиминация некоторых вирусов, и 10 % клонов оздоровить не удалось. Были полностью оздоровлены 16 клонов (69,6 %) с простой инфекцией и 26 клонов (38,2 %) со смешанными инфекциями. В остальных случаях после применения комбинированной терапии число клонов с множественной вирусной инфекцией снизилось. Так, не выявлялись клоны с четырьмя-пятью видами вирусов, значительно снизилось число микрорастений с двумя вирусами (см. рис. 2, Б). Эти результаты согласуются с данными других авторов (16, 27) по сравнительному изучению эффектов комбинированной терапии на растениях картофеля со смешанной (YВК, SВК, ВСЛК, ХВК) и простыми вирусными инфекциями. В то же время I.A. Nasir c cоавт. (37) сообщают об оздоровлении растений картофеля со смешанной инфекцией от вирусов S, M, X и отмечают полное отсутствие эффекта оздоровления от YВК и ВСЛК.

Мы не обнаружили существенных различий в частоте оздоровления растений, инфицированных разными вирусами (см. рис. 2, табл. 3). В целом по выборке (91 клон) ВСЛК был элиминирован у 72,7 % микрорастений, YВК — у 71,4 %, MВК — у 63,9 % и SВК — у 57,4 % клонов. При этом различия между изученными культурными видами картофеля по эффективности оздоровления от каждого из вирусов также не были значимыми (р > 0,05).

Рис. 2. Доля клонов (%) среди образцов культурных видов картофеля с различными вирусными инфекциями до (А) и после (Б) применения предложенной схемы комплексной термо-химиотерапии in vitro: Y, X, S, M и L — соответственно Y-, X-, S-, M-вирус картофеля и вирус скручивания листьев картофеля.

М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 15 16 М М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 15 16 М

Рис. 3. Пример ОТ-ПЦР-тестирования микрорастений культурных видов картофеля на наличие Y-вируса картофеля (а) , вируса скручивания листьев картофеля (б) , Х-вируса картофеля (в) , S-вируса картофеля (г) , М-вируса картофеля (д) при применении предложенной схемы комплексной термо-химиотерапии с контролем эффективности синтеза матрицы кДНК (е) : 1 — полевое растение клона Solanum tuberosum ssp. tuberosum (номер в коллекции ВИР к-3414), которое по результатам ИФА-анализа поражено всеми пятью вирусами (положительный контроль), 2 — вода (отрицательный контроль); 3 и 4 — клон S. tuberosum ssp. andigenum (к-3172), 5 и 6 — клон S. tuberosum ssp. andigenum (к-3240), 7 и 8 — клон S. tuberosum ssp. andigenum (к-17961), 9 и 10 — клон S. phureja (к-12789), 11 и 12 — клон S. phureja (к-5642), 13 и 14 — клон S. stenoto-mum (к-8929), 15 и 16 — клон S. phureja (к-9835) (попарные сравнения результатов ОТ-ПЦР до и после проведения терапии); М — маркер молекулярных масс 100 b.p. + 1500 («СибЭн-зим», Россия). ОТ-ПЦР — ПЦР с обратной транскрипцией, ИФА — иммуноферментный анализ; ВИР — Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова.

3.    Частота (%) оздоровления микрорастений культурных видов картофеля от вирусов при применении предложенной схемы комплексной термо-химиотерапии (n = 91, X±x)

Вирус	Solanum phureja	S. stenotomum	S. tuberosum ssp . andigenum	S. tuberosum ssp. tuberosum	Всего по выборке
XВК	0 в	0 в	50,0±50,0а, б, в	100,0±0,0а	80,0±20,0а, б
YВК	33,3±21,1б, в	50,0±18,9б	93,3±6,7а	75,0±9,9а, б	71,4±6,5а, б
SВК	77,8±14,7а, б	23,1±12,2в	57,1±13,7б	81,8±12,2а, б	57,4±7,3б
MВК	63,6±15,2а, б	66,7±9,8а, б	61,1±11,8б	63,2±11,4а, б	63,9±5,7а, б
ВСЛК	66,7±33,3а, б	100,0±0,0а	77,8±14,7а, б	66,7±11,4б	72,7±7,9а, б

П р и м е ч а н и е. ХВК, YВК, SВК, MВК — соответственно X-, Y-, S- и M-вирус картофеля, ВСКЛ — вирус скручивания листьев картофеля. Значения, отмеченные одинаковыми буквами, достоверно не различаются (р < 0,05).

Полученные нами результаты определения эффективности оздоровления микрорастений от YВК, МВК и ВСЛК методом комбинированной термо-химиотерапии согласуются с данными литературы (9-11, 27, 38, 42) (см. табл. 1). Выход оздоровленных от SВК растений в нашем исследовании составил 57,4 %, тогда как в других работах (11, 38) сообщается о почти полной (более 90 %) элиминации указанного вируса. Отметим, что в этих исследованиях для тестирования авторы использовали метод ИФА (11, 38), обладающий меньшей чувствительностью по сравнению с применяемым нами ОТ-ПЦР-анализом. Обобщение данных литературы показывает, что в большинстве исследований комплексной терапии подвергались единичные образцы картофеля (16, 17) или очень небольшое число образцов (38, 42), пораженных в основном простыми вирусными инфекциями (17).

Итак, нами предложена модифицированная схема комплексной термо-химиотерапии микрорастений картофеля с контролем вирусной инфекции методом ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). В настоящей работе, применив эту схему, мы получили сопоставимые по эффективности результаты элиминации пяти наиболее вредоносных вирусов на обширной выборке генетически разнообразного материала — 85 образцах (91 клон) трех культурных видов картофеля, что указывает на перспективность дальнейшего использования модифицированного метода термохимиотерапии в центрах генетических ресурсов растений. Предложенная модификация отличается от известных протоколов одновременным воздействием повышенной температуры и рибавирина, а также меньшим числом этапов обработки.