Параметры циркулирующих в крови опухолевых клеток в период проведения системной терапии при первичном раке молочной железы
Автор: Михайлов И.В., Гребенник И.В., Глазков А.А., Круглова И.А., Кузнецова С.А., Балканов А.С.
Журнал: Сибирский онкологический журнал @siboncoj
Рубрика: Лабораторные и экспериментальные исследования
Статья в выпуске: 2 т.25, 2026 года.
Бесплатный доступ
Циркулирующие в крови опухолевые клетки (ЦОК) часто исследуют с точки зрения их прогностической значимости при системной терапии в периоперационном периоде (СТпери) первичного рака молочной железы (пРМЖ). Пока не ясно, существуют ли уникальные особенности изменения параметров ЦОК, которые можно использовать в качестве предиктора эффективности неоадъювантной (неоСТ) или адъювантной (аСТ) системной терапии. Цель исследования – сравнительный анализ параметров однократно выделенных ЦОК у пациенток с пРМЖ с высоким риском прогрессирования, получающих неоСТ или аСТ. Материал и методы. В исследование включено 39 пациенток с пРМЖ, получивших неоСТ (1-я группа, n=16) или аСТ (2-я группа, n=23). Забор крови для выделения ЦОК методом микрофильтрации осуществлялся однократно, после 2–5 циклов СТпери. Результаты. Количество ЦОК позитивных пациенток (1-я группа – 87,5 %, 2-я группа – 82,6 % пациенток), частота выделения 5 и более ЦОК (37,5 и 52,2 % пациенток в 1-й и 2-й группах соответственно, р=0,563), а также кластеров ЦОК (у 56,2 и у 43,5 % пациенток в 1-й и 2-й группах соответственно, р=0,646) в группах неоСТ или аСТ оказались сравнимыми. Не установлено существенных различий количественных параметров (Ме) ЦОК (1-я группа – 3 [1,8; 7,8] ЦОК, 2-я группа – 5 [2; 6,5] ЦОК, р=0,785). Вне зависимости от группы у большинства пациенток кластеры ЦОК состояли из 2–3 клеток (в 1-й группе у 88,9 %, во 2-й – у 100 % пациенток). При СТпери выделение большого числа ЦОК ассоциировалось с обнаружением кластеров ЦОК и наличием лимфогенных метастазов. Заключение. При неоСТ и аСТ количество и характеристики ЦОК существенно не отличались, что может указывать на незначительное влияние резекции молочной железы на вышеперечисленные параметры. Полученные данные также могут свидетельствовать о сравнимой прогностической значимости параметров выделенных ЦОК у пациенток с пРМЖ при прогнозе эффективности СТпери безотносительно последовательности, в которой осуществлялись системная терапия и хирургическое вмешательство.
Рак молочной железы, циркулирующие опухолевые клетки, кластеры, системная терапия, периоперационный период, микрофильтрация, цитологический анализ
Короткий адрес: https://sciup.org/140314625
IDR: 140314625 | УДК: 618.19-006.6-08-091.8:616.15 | DOI: 10.21294/1814-4861-2026-25-2-67-79
Circulating tumor cell parameters during systemic therapy in primary breast cancer
Circulating tumor cells (CTCs) are frequently studied in terms of their prognostic significance during perioperative systemic therapy (periST) for breast cancer (BC). It is not yet clear whether there are unique changes in the CTC parameters that could be used as a predictor of the effectiveness of neoadjuvant (neoST) or adjuvant (aST) systemic therapy. The aim of the study was a comparative analysis of parameters of once-isolated CTCs in BC patients with high risk of progression, who received neoST or aST. Material and Methods. The study included BC 39 patients who received neo-ST (group 1: 16 patients) or aST (group 2: 23 patients). Blood sampling for CTC isolation using microfiltration was performed after 2–5 cycles of periST. Results. No significant differences in the number of CTC-positive patients (87.5 % in group1 and 82.6 % in group 2) and the frequency of isolation of 5 or more CTCs (37.5 % in group 1 and 52.2 % in group 2, p=0.563), as well as CTC clusters (56.2 % and 43.5 % of patients in groups 1 and 2 groups, respectively, p=0.646) between the neoST and aST groups were found. There were no significant differences in the quantitative parameters (Me) of CTCs between the groups (1 group – 3 [1.8; 7.8] CTCs, 2 group – 5 [2; 6.5] CTCs, p=0.785). Regardless of the group, most patients had CTC clusters consisting of 2 to 3 cells (88.9 % and 100 % of patients in groups 1 and 2, respectively). During peri ST, a high count of CTCs was associated with the detection of CTC clusters and the presence of lymphatic metastases. Conclusion. No significant differences in CTC count and characteristics between the neoST and aST groups were found. It indicates that breast tumor resection has a minor effect on CTC parameters. . The findings highlight that CTCs hold similar prognostic value regardless of whether they are measured before or after surgery, aiding in the prediction of periST.
Текст научной статьи Параметры циркулирующих в крови опухолевых клеток в период проведения системной терапии при первичном раке молочной железы
Доля рака молочной железы (РМЖ) среди ежегодно выявляемых случаев онкопатологии у женщин составляет 31 %, что соответствует 1-му месту в структуре онкологической заболеваемости. Являясь ежегодной причиной гибели 15–16,6 % онкологических пациенток, РМЖ занимает лидирующие позиции (2-е место) и в структуре онкологической смертности [1, 2]. В подавляющем числе случаев (75,5 %) смерть пациенток с РМЖ вызвана развитием отдаленных метастазов (ОМ) [3], которые в течение первых 5 лет после выявления первичной опухоли молочной железы (пРМЖ) диагностируются у 20 % пациенток [4]. При прогрессировании метастазы в костях выявляются у 60–75 %, в легких – у 32–37 %, в печени – у 32–35 %, в головном мозге – у 10 % пациенток [5, 6]. Даже при Т1 (предиктор низкого риска ОМ) прогрессирование ежегодно выявляется у 1 % пациенток [4].
Для снижения риска прогрессирования пРМЖ в периоперационном периоде используют неоадъювантную (неоСТ) или адъювантную (аСТ) системную терапию [7–10]. Предикторами эффективности системной терапии в периоперационном периоде (СТпери) являются клинико-морфологические признаки высокого риска прогрессирования. Сравнительный анализ чувствительности опухоли к неоСТ и аСТ, основанный на выживаемости пациенток, установил, что оба вида СТпери равно эффективны [7, 8, 10]. Среди преимуществ неоСТ отмечают возможность использовать сразу после ее завершения еще один предиктор эффективности лечения, основанный на динамике изменения размеров опухоли [11–13]. В отношении аСТ не существует предикторов, дающих возможность оценить степень цитотоксического эффекта в момент ее проведения или сразу после завершения лечения. В этой связи очевидна необходимость поиска новых биомаркеров, использование которых на самых ранних этапах лечения пРМЖ (в период проведения СТпери) позволит установить степень толерантности опухоли к проводимой терапии.
Предпринимаются попытки использовать результаты выделения циркулирующих в крови опухолевых клеток (ЦОК) в качестве предиктора эффективности СТпери при пРМЖ. Известно, что пациентки, в крови которых до начала СТпери выявлены ЦОК, имеют значимо меньшую без-рецидивную выживаемость, чем пациентки, у которых ЦОК не были найдены [11, 13–16]. Пока не выявлена взаимосвязь между концентрацией ЦОК и уже известными предикторами, например ответом опухоли на неоСТ [11–13]. Наоборот, даже однократное обнаружение ЦОК при проведении СТпери некоторыми авторами уже предлагается рассматривать как независимый предиктор, свидетельствующий о резистентности опухоли к терапии и, как следствие, о высоком риске прогрессирования [14–19]. Вместе с тем, современные представления о патогенезе формирования пула ЦОК до и после операции у пациенток с пРМЖ, а также данные, свидетельствующие о возможном уменьшении числа ЦОК при резекции опухоли [11, 14, 20], дают основание предполагать наличие уникальной прогностической значимости концентрации ЦОК в период проведения того или иного вида СТпери.
Цель исследования – сравнительный анализ количества выделяемых ЦОК в качестве раннего предиктора эффективности лечения у пациенток с пРМЖ с высоким риском прогрессирования, получающих неоСТ или аСТ.
Материал и методы
В проспективное исследование включено 39 пациенток с пРМЖ высокого риска прогрессирования (табл. 1), которые получали СТпери в ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского с октября 2023 г. по декабрь 2024 г. Шестнадцати пациенткам проводилась неоСТ (1-я группа), 23 – аСТ (2-я группа). Основанием для назначения CTпери являлось наличие следующих признаков высокого риска прогрессирования пРМЖ: лимфогенное метастазирование (N+), размер опухоли ≥2 см, HER2 позитивный (HER2+) или триплнегативный (ТПн) статус, Ki67>20 %, G3. В группе неоСТ критерий Т определялся на основании данных инструментального обследования, в группе аСТ – на основании морфологического исследования операционного материала.
Для выделения ЦОК забор крови осуществлялся однократно, после 2–5 циклов СТпери. Выделение ЦОК осуществлялось методом микрофильтрации: 7,5 мл цельной крови, взятой из локтевой вены в пробирку с К3ЭДТА, разбавляли в 2 раза фосфатносолевым буфером (ФСБ, рН 7,4), содержащим 1 % бычьего сывороточного альбумина (БСА). Полученный раствор с помощью шприцевого насоса прокачивали со скоростью 0,5 мл/мин через поли-карбонатную трековую мембрану с порами диаметром 7 ± 0,5 мкм и плотностью пор 2×104/см2 (it4ip, Бельгия). При этом клетки крови проходят сквозь поры трековой мембраны, а ЦОК задерживаются на поверхности мембраны. После окончания фильтрации трековую мембрану с находящимися на ее поверхности клетками заливали чистой телячьей сывороткой, помещали на предметное стекло и высушивали. Анализ клеток проводился с помощью световой микроскопии в светлом поле при ×1000.
Для иммуноцитохимического окрашивания эпителиальную молекулу адгезии (EpCAM), высушенную трековую мембрану с находящимися на ее поверхности клетками в течение 10 сек фиксировали 10 % раствором формалина в этаноле, отмывали в фосфатно-солевом буфере, выдерживали в 100 мМ растворе глицина в течение 10 мин, затем забивали 1 % раствором БСА в ФСБ в течение 1 ч. После забивки образец инкубировали 1 ч с первичными моноклональными мышиными антителами к EpCAM (клон VU-1D9, ПраймБиоМед) в концентрации 20–50 мкг/мл, отмывали 1 % БСА на ФСБ, инкубировали 1 ч с вторичными козьими антителами к мышиным IgG, конъюгированными с пероксидазой хрена, отмывали 1 % БСА на ФСБ, выдерживали 1 ч с тиаминобензидином (Сигма), после чего отмывали водой и высушивали. Для визуализации ядра клетку затем окрашивали по Паппенгейму.
Для иммунофлуоресцентного окрашивания образец фиксировали и забивали, как описано выше; в качестве первичных антител использовали моноклональные мышиные антитела к EpCAM, конъюгированные с флуоресцеин изотиоцианатом (FITC) (ПраймБиоМед).
Все инкубации проводили при комнатной температуре.
Клеточная суспензия исследовалась двумя независимыми цитологами (И.К. и С.К.). Идентификацию ЦОК после окраски по Паппенгейму проводили на основании следующих цитоморфоло-гических критериев (рис. 1): диаметр клетки больше 12 мкм, высокий ядерно-цитоплазматический индекс, эксцентрично расположенное ядро, нарушения контура ядерной мембраны (неравномерность, извилистость, с грубыми вырезами), гиперхромия ядра, грубоглыбчатая или крупнозернистая структура хроматина, складчатое ядро, гипертрофия ядрышек. Также признаками злокачественности считали наличие многоядерных клеток с полиморфными ядрами и образование кластеров. Кластерами считали скопления из нескольких соприкасающихся клеток, содержащих хотя бы одну ЦОК. Кластеры, состоящие только из ЦОК, считали гомотипическими, содержащие также нормальные клетки крови – гетеротипическими. Кластеры разделяли на небольшие (состоящие из 2–3 клеток) и крупные, содержащие 4 и более
Таблица 1/Table 1
Характеристики пациенток с первичным раком молочной железы, получавших системную терапию в периоперационном периоде
Characteristics of BC patients who received perioperative systemic therapy
СТпери/peri ST (n=39)
|
Параметры/Parameters |
1-я группа, неоСТ/ Group 1, neoST (n=16) |
2-я группа, аСТ/ Group 2, aST (n=23) |
p |
|
|
Возраст, лет/ Age,years |
M ± SD Me [LQ; UQ] min-max |
54,6 ± 11,1 56 [48; 60,2] 35–75 |
59,9 ± 10,3 64 [54; 67] 35–73 |
0,119a |
|
T |
< 3 см [95 % ДИ] ≥ 3 см [95 % ДИ] |
10 (62,5 %) [38,6 %; 81,5 %] 6 (37,5 %) [18,5 %; 61,4 %] |
23 (100 %) [85,7 %; 100 %] 0 (0 %) [0 %; 14,3 %] |
0,002*b |
|
N |
N+ [95 % ДИ] N- [95 % ДИ] |
14 (87,5 %) [64 %; 96,5 %] 2 (12,5 %) [3,5 %; 36 %] |
12 (52,2 %) [33 %; 70,8 %] 11 (47,8 %) [29,2 %; 67 %] |
0,05c |
|
HER+ |
0 [95 % ДИ] 1+ [95 % ДИ] 2+ [95 % ДИ] 3+ [95 % ДИ] |
7 (43,8 %) [23,1 %; 66,8 %] 4 (25 %) [10,2 %; 49,5 %] 0 (0 %) [0 %; 19,4 %] 5 (31,2 %) [14,2 %; 55,6 %] |
12 (52,2 %) [33 %; 70,8 %] 5 (21,7 %) [9,7 %; 41,9 %] 1 (4,3 %) [0,8 %; 21 %] 5 (21,7 %) [9,7 %; 41,9 %] |
0,904b |
|
Кi67 |
M ± SD Me [LQ; UQ] min-max |
42,8 ± 20,3 41 [24,8; 60,8] 15 – 70 |
35,3 ± 17,3 30 [24; 41] 14 – 78 |
0,224d |
|
G |
2 [95 % ДИ] 3 [95 % ДИ] |
4 (36,4 %) [15,2 %; 64,6 %] 7 (63,6 %) [35,4 %; 84,8 %] |
13 (59,1 %) [38,7 %; 76,7 %] 9 (40,9 %) [23,3 %; 61,3 %] |
0,389c |
|
LV |
LV- [95 % ДИ] LV + [95 % ДИ] |
– |
10 (66,7 %) [41,7 %; 84,8 %] 5 (33,3 %) [15,2 %; 58,3 %] |
1b |
|
Pn |
Pn - [95 % ДИ] Pn + [95 % ДИ] |
– – |
13 (86,7 %) [62,1 %; 96,3 %] 2 (13,3 %) [3,7 %; 37,9 %] |
1b |
|
Подтип опухоли/ Subtype of tumor |
А [95 % ДИ] В [95 % ДИ] В/HER [95 % ДИ] HER+ [95 % ДИ] ТПн [95 % ДИ] |
1 (6,2 %) [1,1 %; 28,3 %] 8 (50 %) [28 %; 72 %] 0 (0 %) [0 %; 19,4 %] 5 (31,2 %) [14,2 %; 55,6 %] 2 (12,5 %) [3,5 %; 36 %] |
2 (8,7 %) [2,4 %; 26,8 %] 12 (52,2 %) [33 %; 70,8 %] 1 (4,3 %) [0,8 %; 21 %] 5 (21,7 %) [9,7 %; 41,9 %] 3 (13 %) [4,5 %; 32,1 %] |
0,972b |
