Параметры лейкоцитарной системы крови гадюк Vipera berus berus, V. B. Nikolskii и V. Renardi bashkirovi в серпентарии

рода Vipera (а именно – обыкновенной гадюки V. berus ) не только в естественных, но и в террариумных условиях. Между тем, применение иммуногематологического подхода позволяет вплотную подойти к решению важнейших задач факториальной экологии, связанных с выяснением механизмов адаптации живых организмов к антропогенно измененным условиям среды, а также к оптимизации условий содержания, разведения и эксплуатации ядовитых змей.

Целью работы являлась оценка интегральных лейкоцитарных показателей крови гадюко-вых змей рода Vipera в условиях серпентария.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

По четыре самки гадюк были отловлены в июле 2017 г.: обыкновенная гадюка номинативного подвида Vipera berus berus – в Красноглин-ском районе г. Самара; гадюка Никольского V. b. nikolskii – в Лысогорском районе Саратовской области, окрестности д. Старая Красавка; гадюка Башкирова Vipera renardi bashkirovi – в Сергиевском районе Самарской области, окрестности с. Ендурайкино. Пойманные змеи были размещены в серпентарии Института экологии Волжского бассейна РАН, г. Тольятти. Все работы проводили в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» [7]. В условиях серпентария 4 самки гадюки обыкновенной и 4 самки гадюки Никольского при- несли потомство с 10.08 по 28.08. Самки гадюки Башкирова потомства не дали. В период с 21.08 29.08 у всех 12 самок и части родившихся гадюк (гадюка обыкновенная – 13, гадюка Никольского – 24) была взята кровь для анализа. Для получения образцов крови животных обездвиживали путём захвата, после чего делали пункцию верхнечелюстной вены иглой, смоченной в растворе гепарина. По общепринятым гематологическим методикам от каждого животного готовили по три мазка (окраска по Романовскому-Гимзе). Готовые мазки просматривали с иммерсией, при увеличении ×1600, с дифференцированным подсчётом лейкоцитов [8]. С учетом морфологических особенностей определяли шесть типов лейкоцитарных клеток (в %): гранулоциты (гетерофилы, базофилы, эозинофилы) и агранулоци-ты (азурофилы, моноциты, лимфоциты).

На основании лейкоцитарной формулы крови были рассчитаны интегральные лейкоцитарные индексы (отн. ед.):

• 1)    индекс сдвига лейкоцитов,

^^д   ^' гранулоцитов

^ агранулоцитов

• 2)    индекс соотношения лимфоцитов и эози-

  нофилов, ИСЛЭ =

  
  

  д. Д

  
  

• 3)    индекс соотношения гетерофилов и эози-

  г_.

  ^;

  э

  
  

  нофилов, ИСГЭ =

  
  

• 4)    лимфоцитарно-гранулоцитарный индекс,

  ИЛГ =

  
  

  Д • 10

  э + г + Б ’

  
  

• 5)    индекс соотношения гетерофилов и лим-

  фоцитов, ИСГЛ

  
  

  г

  ^, д

  
  

где Л – лимфоциты; Э – эозинофилы; Г – гетерофилы; Б – базофилы.

Анализ данных проводили методами непараметрической статистики с расчетом критериев Краскела-Уоллиса ( H ) (при множественном сравнении независимых групп по одному признаку), Манна-Уитни ( U ) (при сравнении независимых групп по одному признаку), Данна ( D ) (множественный критерий при попарном сравнении групп) в пакете прикладных программ «Статистика». Классификацию выборок проводили кластерным анализом. За величину статистической значимости принимали a =0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что обыкновенные гадюки из Самарской и Саратовской областей обладают смешанными признаками двух подвидов – номинативного подвида V. b. berus и лесостепного подвида V. b. nikolskii [9]. В наших выборках у гадюк из Самары превалировали признаки номинативной формы, а у гадюк из Саратовской области – признаки гадюки Никольского. По нашим данным, лейкоцитарный профиль и интегральные показатели лейкограмм самок V. b. berus и V. b. nikolskii, содержащихся в условиях серпентария, статистически значимо не отличались (табл. 1 и 2), что свидетельствовало о формировании сходных адаптивных реакций в организме самок двух подвидов.

По лейкоцитарному составу крови сеголетки обыкновенной гадюки отличалась от родивших их самок пониженным содержанием гетерофилов ( U =2,40, a =0,01). В отношении других показателей лейкоцитарного состава значимых отклонений не выявлено (табл. 1). Пониженная доля гетерофилов у родившихся особей отразилась на показаниях расчетных интегральных индексов крови. Так, индекс соотношения гетерофилов к лимфоцитам ( ИСГЛ ) молодых обыкновенных гадюк был в 1.8 раза ниже по сравнения с самками, что свидетельствовало о более высокой функциональной активности неспецифической защитной системы крови у взрослых самок после родов по сравнению с молодью. Отметим, что гадюки обыкновенные, отловленные в лесопарковой городской зоне Самары, по опубликованным нами ранее данным, имели более низкие показатели ИСЛ – 0,27±0,02 (2013–2014 гг.) [5] и 0,29±0,01 (2014–2015 гг.) [10]. Повышение этого показателя у самок V. berus, обусловленное повышением содержания в крови эозинофилов и перераспределением соотношения доли гранулоцитов и агранулоцитов, вероятно, связано с напряженностью компенсаторных процессов организма и снижением адаптивных реакций иммунитета при относительно длительном содержании в условиях серпентария.

Сеголетки V. b. nikolskii по сравнению с родившими их самками характеризовались пониженным содержанием в периферической крови азурофилов ( U = 2,50, p =0,01) (табл. 2). Отношение гетерофилов к лимфоцитам ( ИСГЛ ) у молодых гадюк Никольского, как и у молодых обыкновенных гадюк, оказалось значимо ниже по сравнению с самками ( U =2,04, p =0,04), что косвенно свидетельствовало о возрастании специфической реактивности организма неполовозрелых особей в условиях серпентария.

Различия по лейкоцитарным показателям крови между сеголетками гадюк V. b. berus и V. b. nikolskii были слабо выражены и статистически незначимы.

Кластерный анализ с использованием дистанции Махаланобиса позволил сравнить лейкоцитарные показатели крови исследованных

Таблица 1. Лейкоцитарный состав периферической крови родивших самок ( n =4) и сеголеток ( n =13) гадюки обыкновенной Vipera berus berus

Статистические показатели	Гетерофи -лы, %	Базофилы, %	Эози-нофи -лы, %	Азурофи -лы, %	Моноциты, %	Лимфо -циты, %	ИСЛ , отн. ед.	ИСЛЭ , отн. ед.	ИСГЭ , отн. ед.	ИЛГ , отн. ед.	ИСГЛ , отн. ед.
Самки
M	9,25	7,75	13,50	8,75	5,75	55,00	0,44	4,07	0,69	18,14	0,17
m	0,96	0,25	0,28	1,49	1,81	2,73	0,02	0,18	0,06	1,30	0,02
Сеголетки
M	5,07	11,15	12,84	7,92	5,92	57,23	0,41	5,15	0,43	22,12	0,09
m	0,73	1,18	1,28	0,91	0,92	3,35	0,04	0,71	0,07	2,90	0,01
Различия самок и сеголеток
U	2,40	1,66	1,08	0,34	0,05	0,45	0,51	0,84	1,58	0,39	1,98
p	0,01	0,09	0,27	0,73	0,95	0,65	0,60	0,39	0,11	0,69	0,04

Примечание: M - среднее арифметическое, m - ошибка среднего арифметического, U - критерий Манна-Уитни; p - достигнутый уровень значимости; жирным шрифтом выделены статистически значимые различия ( a =0,05)

Таблица 2. Лейкоцитарный состав периферической крови родивших самок ( n =4) и сеголеток ( n =24) гадюки Никольского Vipera berus nikolskii

Статистические показатели	Гетерофи -лы, %	Базофилы , %	Эози-нофи -лы, %	Азурофи -лы, %	Моноциты, %	Лимфо -циты, %	ИС , отн. ед. Л	ИСЛЭ , отн. ед.	ИСГЭ , отн. ед.	ИЛГ , отн. ед.	ИСГЛ , отн. ед.
Самки (4)
M	7,00	7,25	13,5	10,75	7,00	54,50	0,39	4,05	0,53	19,83	0,13
m	0,41	1,11	0,29	0,63	0,41	0,96	0,03	0,13	0,03	1,28	0,008
Сеголетки (24)
M	5,33	11,70	13,62	6,87	6,70	55,75	0,45	4,64	0,46	20,53	0,09
m	0,41	1,47	0,82	0,52	0,81	2,31	0,03	0,44	0,06	2,03	0,008
Различия самок и сеголеток
U	1,50	0,98	0,09	2,50	0,46	0,42	0,49	0,03	0,75	0,68	2,04
p	0,13	0,32	0,92	0,01	0,64	0,66	0,62	0,97	0,45	0,49	0,04

Примечание: M - среднее арифметическое, m - ошибка среднего арифметического, U - критерий Манна-Уитни; p - достигнутый уровень значимости; жирным шрифтом выделены статистически значимые различия ( a =0,05)

подвидов змей в разные фазы онтогенеза. Один выделенный кластер (рисунок) составили сеголетки двух подвидов обыкновенной гадюки ( V b. berus и V b. nikolskii ) и половозрелые самки гадюки Башкирова ( V. r. bashkirovi ). По совокупности исследованных иммуногематологических показателей молодые особи гадюки Никольского и гадюки обыкновенной оказались наиболее сходны, что подтверждалось наименьшим расстоянием Махаланобиса.

Сравнение лейкоцитарных показателей крови исследованных подвидов змей в разные фазы онтогенеза кластерным анализом на основании дистанции Махаланобиса (относительной связи) показало выделение двух кластеров (рисунок). Один кластер составляли сеголетки двух подвидов обыкновенной гадюки (V. b. berus и V. b. nikolskii) и половозрелые самки гадюки Башкирова (V. r. bashkirovi). По совокупности исследованных иммуногематологических по- казателей молодые особи гадюки Никольского и гадюки обыкновенной оказались наиболее сходны, что подтверждалось наименьшим расстоянием относительной связи.

Самки V. r. bashkirovi располагались на достаточном расстоянии от неполовозрелых особей, что свидетельствовало о специфической адаптивной реакции гадюки Башкирова. Эта форма, описанная в качестве подвида восточной степной гадюки, совмещает признаки V. berus и V. renardi [11]. В пользу гибридогенного происхождения гадюки Башкирова свидетельствует доказанная естественная гибридизация гадюк восточной степной и обыкновенной [12].

В отдельный кластер вошли взрослые самки V. b. berus и V. b. nikolskii , что подтверждало схожесть адаптивных реакций системы крови двух подвидовых форм. Как уже было отмечено, по лейкоцитарному составу самки этих подвидов гадюк между собой были сходны, при этом не-

Рис. Дендрограмма сходства выборок гадюк по гематологическим показателям которые показатели крови V b. berus статистически значимо различались с аналогичными показателями V r. bashkirovi. Так, самки номинативной формы обыкновенной гадюки характеризовались повышенным содержанием в крови гетерофилов (D 1-3=2,50, p=0,03), высокими показателями интегральных индексов (ИСЛ и ИСГЛ) и низкими показателями индексов (ИСЛЭ и ИЛГ) по сравнению с самками гадюки Башкирова (табл. 3).

Известно, что доля гетерофилов в крови возрастает в ответ на инфекции, воспаление и раздражающие внешние воздействия [13, 14 и др.]. Отношение гетерофилов к лимфоцитам ( ИСГЛ ) рассматривается как составная мера реакции на стресс [4]. Отметим, что доля лимфоцитов в

Таблица 3. Лейкоцитарный состав периферической крови самок гадюк

Статистические показатели	Гетерофилы, %	Базофилы, %	Эозинофилы, %	Азурофилы, %	Моно ци-ты, %	Лимфоциты, %	ИСЛ , отн. ед.	ИСЛЭ , отн. ед.	ИСГЭ , отн. ед.	ИЛГ , отн. ед.	ИСГЛ , отн. ед.
1. Vipera berus berus
M	9,25	7,75	13,50	8,75	5,75	55,00	0,44	4,07	0,69	18,14	0,17
m	0,96	0,25	0,28	1,49	1,81	2,73	0,02	0,18	0,06	1,30	0,02
2. Vipera berus nikolskii
M	7,00	7,25	13,5	10,75	7,00	54,50	0,39	4,05	0,53	19,83	0,13
m	0,41	1,11	0,29	0,63	0,41	0,96	0,03	0,13	0,03	1,28	0,008
3. Vipera renardi bashkirovi
M	5,50	7,00	9,00	8,25	7,25	63,00	0,27	7,47	0,66	29,74	0,09
m	0,86	1,00	1,35	0,75	0,48	1,83	0,02	1,06	0,14	2,63	0,01
Статистические различия
Н	6,71	1,01	6,34	3,29	1,57	6,33	7,90	7,42	3,55	8,03	7,79
p	0,03	0,50	0,04	0,19	0,46	0,04	0,02	0,02	0,17	0,02	0,02
D 1-3	2,50	-	-	-	-	-	2,64;	2,45	-	2,74;	2,75
p	0,03	-	-	-	-	-	0, 02	0,04	-	0,01	0,01

Примечание: M - среднее арифметическое, m - ошибка среднего арифметического, Н- критерий Краскелла-Уоллеса , D - критерий Данна, p - достигнутый уровень значимости; жирным шрифтом выделены статистически значимые различия ( a =0,05)

крови самок змей изменялась незначительно и составляла 50–65% от всех форменных элементов белой крови. Однако повышенное значение интегрального индекса ИСЛ (0,44±0,02, D _1-3 =2,64, a =0,02) у самок V. b. berus по сравнению с самками V. r. bashkirovi свидетельствовало о признаках снижения адаптивных реакций иммунной системы организма, что, по-видимому, компенсировалось повышением функциональной активности неспецифической защитной системой крови (содержанием гетерофилов) в условиях серпентария.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Показано, что параметры лейкоцитарной системы крови молодых змей рода Vipera отличались от показателей крови взрослых особей. Более выраженные различия выявлены в долевом составе гранулоцитов. Молодые особи гадюки обыкновенной V. b. berus характеризовались пониженным содержанием гетерофилов, неполовозрелые особи V. b. nikolskii – азурофилов. Более низкие показатели индекса соотношения гетерофилов к лимфоцитам ( ИСГЛ ) у молодых особей по сравнению с самками отражали хороший адаптивный ответ и устойчивое функционирование организма. По интегральным лейкоцитарным показателям крови неполовозрелые особи двух подвидов обыкновенной гадюки ( V. b. berus и V. b. nikolskii ) между собой статистически значимо не различались. Кластерный анализ подтвердил сходство эколого-физиологических механизмов адаптации неполовозрелых особей и адаптивных реакций системы крови взрослых самок номинативного подвида гадюки обыкновенной и гадюки Никольского в условиях серпентария. С помощью расчета интегральных лейкоцитарных индексов показана специфическая адаптивная реакция самок гадюки Башкирова V. r. bashkirovi к условиям серпентария.

Авторы благодарят В.К. Шитикова за прочтение рукописи и сделанные замечания.