Патогенетические связи маркеров костного метаболизма и клинико-лабораторных показателей у детей с хронической низкодозовой нагрузкой металлами

В структуре нарушений здоровья детского населения болезни костно-мышечной системы занимают первое место, что предопределяет социально-экономические потери общества. На территориях интенсивного промышленного освоения с высокой степенью техногенной химической нагрузки окружающей среды острота этих проблем особенно высока (Л.А. Щепляги-на, 2003). Нарушение формирования костной массы в детском возрасте создает реальные предпосылки развития остеопороза у взрослых (Е.Е. Михайлов, 2001; Л.Я. Рожинская, 2001). Среди причин формирования остеопенических состояний у детей наибольшее значение имеют генетические факторы, нарушения минерального и витаминного обменов, неполноценное питание, различные патологические процессы, сопровождающиеся нарушением продукции кальцийрегулирующих и системных гормонов, усилением свободнорадикальных процессов. Особую роль играет поступление в организм ребенка токсических веществ промышленного происхождения, прежде всего тяжелых металлов (Л.А. Щеплягина, 2005; Н.В. Торопцова, 2005). Конкурентно взаимодействуя с кальцием в костной ткани и разбалансируя витаминноминеральный обмен, тяжелые металлы в ходе длительной кумуляции и метаболизма приводят к деминерализации костной ткани (Л.А. Щепля-гина, 1998). Спектр воздействий на молекулярном, тканевом, клеточном и системном уровнях во многом зависит от экспозиции токсического вещества, комбинации его с другими факторами, предшествующего состояния здоровья ребенка, его иммунологической реактивности, наличия генетически обусловленной чувствительности к влиянию ксенобиотиков (В.С. Масюк, 2003). Вместе с тем следует отметить, что до настоящего времени остаются малоизучен- ными механизмы влияния ксенобиотиков, распределенных в областях быстрого обмена, на процессы костного метаболизма.

Комплекс этих вопросов является весьма актуальным для Пермского края, где заболевания костно-мышечной системы у детей уже в дошкольном возрасте становятся преобладающим видом патологии. За последние 10 лет по промышленным городам края на фоне роста загрязнения окружающей среды веществами I-III классов опасности прирост заболеваемости детей болезнями костно-мышечной системы в среднем составил более 1200%. Распространенность этой патологии до 1,5 раз превышает среднероссийский уровень. Таким образом, исследование механизмов влияния токсикантной нагрузки на процессы ремоделирования костной ткани весьма актуально.

Цель исследования : выполнить анализ патогенетических взаимосвязей маркеров костного метаболизма и клинико-лабораторных показателей при хроническом низкодозовом воздействии тяжелых металлов.

Материалы и методы

В исследовании использованы: комплекс иммунологических, биохимических, химикоаналитических методов, методы математического моделирования, элементы системного анализа и расчет рисков. Объектом исследования являлись дети, проживающие в условиях постоянной техногенной химической нагрузки (на примере городов Пермского края Лысьва и Чусовой) и в условиях относительно благоприятной санитарно-гигиенической ситуации. Предметы исследований - параметры клиниколабораторных показателей и их межсистемные патогенетически значимые взаимосвязи. Углубленное лабораторное исследование осуществлено по двум выборкам: основная группа – 135

детей в возрасте 7-14 лет, проживающих в городах Чусовой и Лысьва, и группа сравнения – 100 детей в возрасте 7-14 лет, проживающих в условиях относительного санитарно-гигиенического благополучия. Клинико-лабораторная диагностика выполнена с помощью гематологического анализатора"PS-5" (Венгрия), автоматического биохимического "Skreen Master" (США) и им-муноферментного "Stat Faх-2600" (США) анализаторов. Исследование и оценку прооксидантно-антиоксидантного равновесия в организме осуществляли на основании определения общей антиоксидантной активности и содержания малонового диальдегида в плазме крови (И.Д. Стальная, 1977). Исследование гормонального профиля предусматривало определение содержания гормонов методом ИФА с использованием наборов фирмы “Хема-Медика” (Москва). Состояние гуморального иммунитета оценивалось по содержанию сывороточных иммуноглобулинов классов A, M, G (г/дм3) методом иммунодиффузии по G. Mancini. О функционировании системы неспецифической защиты судили по показателям фагоцитарной активности нейтрофилов. Степень сенсибилизации организма оценивали по уровню содержания общего иммуноглобулина Е методом ИФА с использованием тест-системы «Вектор-Бест» (Новосибирск). Показатели костного метаболизма определяли методом моноклональных антител с использованием наборов «Elisa Kit», Дания (N-остеокальцин и C-N концевые телопептиды), «BAP», США (костный изофермент щелочной фосфатазы), «BioVendor», Чехия (тартрат-резистентная фосфатаза). Исследования крови на содержание металлов (свинца, ванадия, хрома, никеля, марганца) выполнены на атомноабсорбционном спектрофотометре Perkin Elmer 3110 с использованием в качестве окислителя ацетилено-воздушной смеси с детектированием в режиме пламенной атомизации, согласно методическим указаниям МУК 44.763-99-4.1.79999 МЗ РФ. Для сравнения использованы показатели содержания контаминантов и микроэлементов в крови 100 практически здоровых детей условно чистых территорий области, без объектов промышленного производства.

Для выявления причинно-следственных связей в нарушении формирования костной систе-

Параметры зависимости вероятности изменения мы разрабатывались математические модели и проводилось многоступенчатое вычисление показателя отношения шансов. Для выявления наличия и патогенетического характера связей активности маркеров костного метаболизма с клинико-лабораторными показателями и параметрами контаминации биосред проведено статистическое моделирование на базе построения моделей логистической регрессии с использованием стандартных (SAS V 6.04, STATGRAF и др.) и специально разработанных программных продуктов. Математическую обработку осуществляли с помощью параметрических методов вариационной статистики. Расчет вероятности изменения исследуемых показателей включал кластерный анализ, анализ временных рядов, множественный корреляционно-регрессионный анализ, факторный анализ. Оценивалась величина относительного риска, этиологической доли токсикантной нагрузки (Э.М. Денисов, 2002), пропорции риска и отношения шансов, осуществлялся расчет атрибутивного риска. Статистические гипотезы относительно параметров моделей оценивались с помощью критериев Стьюдента и Фишера. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты и обсуждение

В ходе моделирования параметров вероятности изменения маркеров костного метаболизма на фоне повышения содержания в крови промышленных токсикантов (табл. 1) установлена взаимосвязь между пониженным уровнем маркеров синтеза костной ткани и наличием в крови промышленных токсикантов в концентрациях, превышающих референтные пределы: свинец – N-остеокальцин (D=0,13), хром – костный изофермент щелочной фосфатазы (D=0,25), марганец – костный изофермент щелочной фосфатазы (D=0,15). Одновременно установлена зависимость повышенного содержания маркера остеорезорбции от наличия в крови токсикантов в концентрациях, превышающих референтные пределы: С-концевые телопептиды – ванадий (D=0,79). Адекватных моделей зависимости вероятного изменения активности тартрат-резистентной кислой фосфатазы от повышения концентрации изучаемых токсикантов не установлено.

Таблица 1 маркеров костного метаболизма от повышенного содержания промышленных токсикантов в крови

Фактор	Маркер остеогенеза	Повышение/(+) Понижение (-)	b 0	b 1	D
Свинец	N-остеокальцин	-	2,04±0,15	7,25±2,79	0,13
Хром	Костный изофермент щелочной фосфатазы	-	0,95±0,02	27,24±5,47	0,25
Марганец	Костный изофермент щелочной фосфатазы	-	0,88±0,03	19,75±4,97	0,15
Ванадий	С-концевые телопептиды	+	2,53±0,09	602,47±10,84	0,79

Таблица 2

Вероятность и атрибутивный риск изменения маркеров костного метаболизма при повышении содержания промышленных

токсикантов в к		рови
Фактор	Маркеры остеогенеза	Повышение / (+) Понижение (-)	р оп	AR, %
Свинец	N-остеокальцин	-	0,26	4,4
Хром	Костный изофермент щелочной фосфатазы	-	0,53	8,2
Марганец	Костный изофермент щелочной фосфатазы	-	0,40	1,9
Ванадий	С-концевые телопептиды	+	0,79	23,0

Углубленный анализ моделей позволил провести количественную оценку вероятности и атрибутивного риска изменений маркеров костного метаболлизма при повышении содержания в биосредах отдельных промышленных токсикантов выше референтного уровня (табл. 2).

В ходе исследования было установлено, что содержание свинца в крови выше референтного предела на уровне 0,1344±0,0001 мг/дм3 увеличивает вероятность снижения содержания N-остеокальцина до 0,26 ниже физиологической нормы, а атрибутивный риск развития этого процесса составляет 4,4%. Если в качестве референтного рассматривать рекомендуемый в настоящее время уровень содержания свинца в крови 0,01 мг/дм3, то при аналогичной вероятности снижения содержания N-остеокальцина атрибутивный риск составляет 13,3% (рис. 1). Анализ влияния хрома на процессы остеосинтеза показал, что при концентрации хрома выше референтной величины, на уровне 0,0395±0,0042 мг/дм3 , вероятность снижения активности костного изофермента щелочной фосфатазы составляет 0,53, а атрибутивный риск – 8,2% (рис. 2). В ходе исследования влияния марганца на процессы остеосинтеза установлено, что при повышении его содержания до уровня 0,0233±0,0005 мг/дм3 вероятность снижения костного изофермента щелочной фосфатазы составляет 0,40, а атрибутивный риск – 1,9%.

Таким образом, анализ показателей вероятности и атрибутивного риска снижения содержания и активности маркеров остеосинтеза в сыворотке крови позволяет говорить о наиболее значимом влиянии на исследуемые процессы хрома и марганца, в то время как на повышение содержания маркера резорбции (С-концевых телопептидов) – ванадия.

Учитывая, что воздействие на организм является не моно-, а поливалентным, рассчитали вероятность изменения маркеров костного метаболизма в ответ на суммарное действие ток-сикантной нагрузки по правилу сочетаний вероятностей независимых в совокупности событий.

Вероятность снижения активности процессов остеосинтеза, опосредованная хронической токсикантной нагрузкой, составила по показателю N-остеокальцина 0,69, а по активности костного изофермента щелочной фосфатазы – 0,95, при этом атрибутивный риск развития достигал 15% и 5% соответственно.

Рис. 1. Модель зависимости содержания N-остеокальцина в сыворотке крови от уровня свинца

Рис. 2. Модель зависимости активности костного изофермента щелочной фосфатазы в сыворотке крови от уровня хрома

Последующее изучение моделей зависимости вероятности изменения клиниколабораторных показателей от уровня содержания в крови токсикантов и моделей зависимости вероятности отклонения маркеров костного метаболизма при изменении клиниколабораторных показателей позволило выявить некоторые звенья патогенеза нарушений метаболизма костной ткани в условиях хронического токсикантного воздействия.

Для дифференциальной оценки степени связи анализируемых моделей была принята градация: пара обладает слабой связью, если 0,1

Установлено, что содержание в крови свинца выше референтного предела приводит к повышению показателей пигментного обмена с высокими связями – свинец–сывороточное железо (D=0,85); заметными – свинец–билирубин прямой (D=0,52); слабыми – свинец–билирубин общий (D=0,1) (рис. 5). С другой стороны, увеличение содержания в крови свинца находится в высокой связи со снижением уровня гемоглобина (D=0,72), общего холестерина (D=0,84) и в заметной связи – с некоторыми показателями неспецифической резистентности (процент фа- гоцитоза – D=0,61). Большинство перечисленных показателей находится в связи с маркерами костного синтеза – N-остеокальцином и костным изоферментом щелочной фосфатазы (рис. 3). Снижение содержания N-остеокальцина имеет слабовыраженную связь с повышением уровня прямого билирубина (D=0,24), снижением общего холестерина (D=0,13) и процента фагоцитоза (D=0,17). Снижение активности костного изофермента щелочной фосфатазы находится в слабой связи с повышением прямого билирубина (D=0,21), сывороточного железа (D=0,27), снижением гемоглобина (D=0,2) и общего холестерина (D=0,08). Повышение активности маркера костной резорбции – тартрат-резистентной фосфатазы – имеет заметную связь с повышением содержания общего билирубина (D=0,55).

Таким образом, содержание в крови свинца выше референтного предела приводит к формированию тесных связей между клиниколабораторными показателями, отражающими формирование гемолитического процесса и нарушения пигментного обмена, и маркерами костного метаболизма. Наиболее существенное воздействие формируется на уровне синтетического звена костного метаболизма (рис. 3).

Повышенное, относительно референтного предела, содержание в крови хрома приводит к

R2=0.24

R2=0.52

Билирубин прям ой

R2=0.85

Ж елезо сывороточное

IR²=0.72

Гемоглобин

R2=0.21

R2=0.27

R2=0.20

R²=0.13 I R²=0.84 -----------₍ R²=0.08

Общий холестерин I

R²=0.17 f R²=0.61

I Процент фагоцитоза

Свинец

R2=0.10

Билирубин общий

R2=0.55

;_____j--— Модели риска занижения зависимого показателя

I      I — Модели риска завышения зависимого показателя

Рис. 3. Патогенетические механизмы влияния свинца на костный метаболизм

:_____j—- Риск снижения показателя

Риск повышения показателя

Рис. 4. Патогенетические механизмы влияния хрома на костный метаболизм изменению показателей гуморального звена иммунного ответа, о чем свидетельствует наличие достоверных моделей слабой связи – хром– иммуноглобулин А (D=0,19), хром– иммуноглобулин М (D=0,19). Повышение содержания хрома в сыворотке крови имеет умеренную связь с понижением уровня альбуминов (D=0,47). В свою очередь, изменение показателей гуморального звена иммунной защиты и уровня альбуминов оказывает влияние на снижение синтетических и активацию резорбтивных процессов костного метаболизма (рис. 4). Снижение содержания N-остеокальцина находится в слабой связи с уровнем иммуноглобулина G (D=0,2), а снижение активности костного изофермента щелочной фосфатазы – в умеренной с иммуноглобулином А (D=0,42) и слабой – с иммуноглобулином М (D=0,21), иммуноглобулином G (D=0,12). Повышение активности маркера костной резорбции (тартрат-резистентной фосфатазы) слабо связано с повышением уровня иммуноглобулина А (D=0,1) и понижением содержания альбуминов (D=0,29).

Таким образом, содержание в крови хрома, превышающее референтный предел, приводит к формированию связей между клиниколабораторными показателями, преимущественно отражающими развитие вторичного иммунодефицита, и маркерами костного метаболизма, отражающими состояние синтетического звена костного метаболизма.

Изучение патогенетических механизмов влияния ванадия в концентрациях выше референтных выявило его высокую связь с повышением иммуноглобулина М (D=0,84), снижением уровня альбуминов (D=0,83) и глюкозы (D=0,83); заметную – с нарастанием антиоксидантной активности крови (D=0,55); умеренную – с повышением абсолютного числа эозинофилов (D=0,42) (рис. 7). Снижение уровня содержания N-остеокальцина слабо связано с повышением иммуноглобулина М (D=0,28), абсолютного числа эозинофилов (D=0,2) и антиоксидантной активности крови (D=0,19). Cнижение активности костного изофермента щелочной фосфатазы имеет заметную связь с понижением содержания глюкозы (D=0,54). Содержание С-концевых телопептидов слабо связано с повышением иммуноглобулина М (D=0,2) и умеренно – с повышением абсолютного числа эозинофилов (D=0,32). Увеличение активности тартрат-резистентной фосфатазы слабо связано со снижением содержания альбуминов (D=0,29) (рис. 5).

Следовательно, содержание в крови ванадия, превышающее референтный предел, сопровождается развитием механизмов активации иммунного ответа, сенсибилизации, антиоксидантной защиты, нарушениями белкового и углеводного обменов. Полученные модели связи

Риск снижения показателя

Рис. 5. Патогенетические механизмы влияния ванадия на костный метаболизм

Риск повыш ения показателя

этих показателей с маркерами костного метаболизма свидетельствуют о наличии сопряженности формирующихся клинико-лабораторных сдвигов как со снижением процессов синтеза, так и с активацией резорбции костной ткани.

Таким образом, содержание в крови ванадия, превышающее референтный предел, сопровождается развитием механизмов активации иммунного ответа, сенсибилизации, антиоксидантной защиты, нарушениями белкового и углеводного обменов. Полученные модели связи этих показателей с маркерами костного метаболизма свидетельствуют о наличии сопряженности формирующихся клинико-лабораторных сдвигов как со снижением процессов синтеза, так и с активацией резорбции костной ткани.

Моделирование связей «содержание в крови марганца выше референтных пределов – клинико-лабораторные данные» позволило выявить адекватные модели со слабой связью: повышение уровня иммуноглобулина М (D=0,13), фагоцитарного индекса (D=0,16), общего билирубина (D=0,16), снижение иммуноглобулинов G (D=0,21), альбуминов (D=0,22), глюкозы (D=0,28); модели с умеренной связью: повышение индекса эозинофилии (D=0,44), скорости оседания эритроцитов (D=0,49), снижение кальция (D=0,39); модель с заметной связью: понижение уровня гемоглобина (D=0,55); модель с весьма высокой связью: повышение содержания Т4 свободного (D=0,93) (рис. 6). Снижение содержания N-остеокальцина связано с повышением показателей специфической и иммунной защиты. Модели демонстрируют наличие слабой связи этого маркера с понижением фагоци- тарного индекса (D=0,09), IgM (D=0,28) и высокой связи с индексом эозинофилии (D=0,80).

Помимо показателей неспецифической и иммунной защиты установлена умеренная связь N-остеокальцина с повышением содержания в крови Т4 свободного (D=0,35). Снижение активности костного изофермента щелочной фосфатазы находится в слабой связи со снижением иммуноглобулина G (D=0,12), гемоглобина (D=0,2) и заметной связи с содержанием глюкозы (D=0,54). Cнижение активности костного изофермента щелочной фосфатазы находится в слабой связи с увеличением содержания в сыворотке крови Т4 свободного (D=0,22) и повышением скорости оседания эритроцитов (D=0,23). Повышение содержания С-концевых телопеп-тидов имеет слабую связь с повышением IgМ (D=0,2), фагоцитарного индекса (D=0,29) и общего билирубина (D=0,19). Увеличение активности тартрат-резистентной фосфатазы имеет слабую связь с фагоцитарным индексом (D=0,19) и увеличением скорости оседания эритроцитов (D=0,11), умеренную – с повышением индекса эозинофилии (D=0,32), заметную – с содержанием кальция (D=0,64).

Таким образом, ванадий, марганец оказывают влияние на оба звена костного метаболизма: супрессируют процессы синтеза с одновременной стимуляцией механизмов резорбции костной ткани. Для остальных изученных токсикантов установлена более узкая направленность влияния: так, для свинца и хрома характерно преимущественное угнетение синтетических процессов остеогенеза. Анализ механизмов формирования нарушений костного

Глюкоза i D=0.55                       D=0.20

Гем лобин        ।

к к

D=0.01

D=0.15

D=0.20

D =0.13

IgM

D=0.32

D=0.29

D=0.19

D=0.49

D=0.11

СОЭ

D=0.19

D=0.29

I D=0.64

Риск снижения показателя

Риск повышения показателя

Рис. 6. Патогенетические механизмы влияния марганца на костный метаболизм

D=0.16

Фагоцитарный индекс

D=0.44

Индекс эозинофилии

D=0.16

Билирубин общий iD=0.22

i    Альбумины iD=0.39

i      Кальций

метаболизма под влиянием хронического токси-кантного воздействия выявил нарушение разнообразных процессов поддержания гомеостаза: иммунологического равновесия, антиоксидантной защиты, гормонального статуса, минерального, белкового и углеводного обменов, развитие сенсибилизации и цитолиза.

Для выявления наиболее значимых связей маркеров костного метаболизма с клиниколабораторными показателями был проведен анализ моделей с учетом принятой градации выраженности связей. N-остеокальцин имеет умеренную связь с повышением содержания Т4 свободного (D=0,35) и гуморальными факторами иммунного ответа (D=0,28), высокая степень связи прослеживается с показателями сенсибилизации (D=0,8). Кислый изофермент щелочной фосфатазы имеет заметную степень связи с состоянием антиоксидантной защиты (D=0,64) и нарушениями углеводного обмена (D=0,54), умеренную связь – с гуморальными факторами иммунного ответа (D=0,42). С-концевые тело-пептиды имеют высокую степень связи с цитолитическим синдромом (D=0,74), заметную – с показателями сенсибилизации (D=0,63), умеренную – с показателями иммунного статуса (D=0,47), слабую – с показателями неспецифической защиты (D=0,29). Активность тартрат- резистентной кислой фосфатазы имеет весьма высокую степень связи с процессами сенсибилизации (D=0,8), заметную – с нарушениями кальциевого обмена (D=0,64), слабую – с нарушениями белкового обмена (D=0,29).

Таким образом, маркеры синтеза имеют высокую и заметную связь с процессами сенсибилизации, антиоксидантной защиты и с состоянием углеводного обмена; гуморальное звено иммунного ответа и гормональный профиль находятся с этими маркерами в умеренной и слабой связи. Маркеры резорбции находятся в весьма высокой, высокой и заметной связи с процессами сенсибилизации, обменом кальция и цитолизом; связь с показателями неспецифической защиты и специфического иммунитета носит умеренный и слабый характер.

На основании полученных данных предложена схема отдельных звеньев патогенетических механизмов нарушений костного метаболизма в условиях хронического токсикантного воздействия (рис. 7).

В основе нарушений костного метаболизма при хроническом токсикантном воздействии лежат процессы нарушения гомеостаза иммунной системы, неспецифической резистентности, гормонального статуса, основных видов обмена и системы крови. Возникающие под действием

Рис. 7. Схема отдельных звеньев патогенетических механизмов нарушения костного метаболизма при хроническом токсикантном воздействии

ацетальдегида, формальдегида, хрома, ванадия и марганца нарушения в иммунной системе (D=0,28-0,32), системе неспецифической резистентности (D=0,50-0,64), гормональном статусе (D=0,22-0,35), углеводном обмене (D=0,54) и системе крови (D=0,20-0,27) провоцируют снижение синтеза белков костного матрикса. С другой стороны, хроническое воздействие на организм ацетальдегида, формальдегида, никеля, хрома, ванадия и марганца в концентрациях, превышающих референтный предел, оказывает через иммунную систему (D=0,20-0,63), факторы неспецифической резистентности (D=0,27-0,33), белковый (D=0,29), минеральный (D=0,27-0,64) обмены и систему крови (D=0,20) стимулирующее действие на функцию остеокластов и деградацию коллагена I типа.

Дискоординация синтетических и резорбтивных процессов в костной ткани, провоцируемых хронической токсикантной нагрузкой, является одной из причин замедления формирования костного скелета, снижения его устойчивости к внешним воздействиям, создает основу для его деформаций и недоразвития.

Выводы

Риск нарушений костного метаболизма, лежащих в основе развития остеопенических состояний у детей, детерминируется прямым (АRΣ – 5,0÷53,0%) и опосредованным воздействием тяжелых металлов и кислородсодержащих соединений на процессы остеосинтеза и резорбции костной ткани с вовлечением основных звеньев минерального (D=0,27÷0,64), пигментного (D=0,2÷0,55), белкового (D=0,29), углеводного (D=0,54) обменов, гуморального иммунитета (D=0,2÷0,63), неспецифической резистентности (D=0,27÷0,64) и адаптационнотиреоидной активности (D=0,22÷0,35).