Патоморфологическая и функциональная оценка нового метода лечения ишемии спинного мозга (экспериментальное исследование)

Введение. Рядом авторов показано, что развитие некроза в зоне ишемии спинного мозга можно избежать с помощью реперфузии и применения нейропротективных препаратов, в частности под воздействием альфа-GPC, церебролизина, пироцетама, винпоцетина [1]. В то же время эффективность нейромедиаторной терапии ишемических повреждений ЦНС после введения указанных препаратов является различной и остаётся невысокой, что диктует необходимость поиска новых методов лечения данной патологии.

В связи с этим, в последние годы большой интерес вызывает эритропоэтин, как средство базисной терапии хронической почечной недостаточности, плейотропные эффекты которого являются объектом пристального внимания исследователей различных специальностей. В частности, установлены нейропротекторные свойства ЭП, связанные с антиапоптотическим и антигипоксическим действиями [2, 4, 5, 7, 8]. Показано, что плейо- тропные эффекты ЭП реализуются за счёт наличия специфических рецепторов на различных клетках, в том числе на нейронах [6]. Поэтому выяснение возможной патогенетической роли ЭП в коррекции ишемических нарушений в спинном мозге представляется весьма перспективным и актуальным.

Цель исследования – сравнительная оценка динамики морфологических изменений в очаге экспериментальной ишемии спинного мозга у крыс под воздействием рекомбинантного ЭП и лазерного излучения.

Материалы и методы. Исходя из цели и задач исследования, нами проведён эксперимент на 80 беспородных половозрелых крысах обоего пола массой 220–250 г. Животные содержались в условиях вивария, регламентируемых приказом МЗ СССР № 1179 от 10.10.1983 г. Опыты проводили в соответствии с приказами МЗ СССР № 755 от 12.09.1977 г. и № 701 от 27.07.1978 г. об обеспечении принципов гуманного обращения с животными.

Все оперативные вмешательства проводились в экспериментальной операционной с соблюдением правил асептики и антисептики под внутримышечным обезболиванием золитилом (2 мг/кг массы тела животного). Выведение животных из эксперимента осуществлялось путём внутрисердечного введения 3 мл 7,5 % раствора хлористого калия. Все животные были разделены на 4 серии опытов.

В 1-й серии экспериментов на 20 животных (группа сравнения) моделировали ишемию спинного мозга по методике, предложенной Г.З. Суфиановой и др. [3]. Транзитор-ную ишемию поясничного отдела спинного мозга создавали путём тотальной интрава-зальной окклюзии и последующим клипированием бедренных артерий. С этой целью в обе бедренные артерии по направлению к сердцу вводили окклюдеры (стерильную нить из хромированного кетгута 3.0), глубину введения которых определяли расстоянием от мечевидного отростка до основания хвоста. Через 45 мин окклюдеры извлекали, а бедренные артерии затем клипировали. Животных выводили из эксперимента на 3, 7, 14, 30-е сут после моделирования ишемии. На каждом сроке наблюдения исследовано 5 крыс.

Во 2-й серии эксперимента на 20 животных моделировали ишемию спинного мозга, по методике описанной выше (1-я серия эксперимента). Через 3 ч после операции каждому животному вводили внутрибрюшинно 1000 МЕ рекомбинированного ЭП («ЭПОКРИН 2000 МЕ») из расчёта 5000 МЕ на 1 кг массы тела животного по международному протоколу. Затем введение препарата повторяли через 24 и 48 ч по 1000 МЕ после создания ишемии. Выведение животных из опыта осуществляли на 3, 7, 14, 30-е сут после моделирования ишемии. На каждом сроке наблюдения исследовано 5 крыс.

На 20 животных 3-й серии экспериментов с моделью ишемии спинного мозга через 2 ч после операции проводили дистанционное накожное (4 см от поверхности кожи) в непрерывном режиме облучение области ишемического очага диодным лазером ALTO с длиной волны 980 нм, используя обоснованные морфологически параметры – мощность 2 Вт, экспозиция 3 мин. Доставка лазерного излучения к объекту осуществлялась с помощью головки излучателя. Животных выводили из опыта на 3, 7, 14, 30-е сут после моде- лирования ишемии. На каждом сроке наблюдения исследовано 5 крыс.

В 4-й серии эксперимента на 20 животных с моделью ишемии спинного мозга через 2 ч после операции проводили накожное облучение диодным лазером с помощью отработанных параметров (3-я серия эксперимента). Затем через 3 ч вводили внутрибрюшинно трёхкратно рекомбинантный ЭП в соответствии с международным протоколом (2-я серия эксперимента). Таким образом, осуществлялось лазерное облучение операционной раны в сочетании с внутрибрюшинным введением рекомбинантного эритропоэтина. Выведение животных из опыта осуществляли на 3, 7, 14, 30-е сут после моделирования ишемии. На каждом сроке наблюдения исследовано 5 крыс.

На всех сроках у животных 1, 2, 3, 4-й серий экспериментов проводили наблюдения за их поведенческими реакциями.

После выведения животных из экспериментов спинной мозг извлекали и фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина. Серийные срезы спинного мозга окрашивали гематоксилином и эозином, по методу Бильшовского для выявления миелиновых волокон, по методу Ниссля для определения тиг-роидного вещества Ниссля, глиальных клеток. Подсчитывали на условной единице площади количество нейронов (нормальных, с хроматолизом, клеток-теней), мелких кровеносных сосудов. Результаты исследования обрабатывали статистически с использованием непараметрического U-теста Манна–Уитни. Различия считали статистически значимыми при уровне P < 0,05.

Результаты и их обсуждение. У всех животных с моделью ишемии спинного мозга (1-я серия опытов) отмечалась симметричная параплегия по периферическому типу, выявляемая сразу после операции. Регистрировалось исчезновение всех видов чувствительности с задних конечностей и поясничной области в сочетании с тазовыми расстройствами через после моделирования ишемии. Такая картина наблюдалась вплоть до 30-х сут опыта. На данном сроке наблюдения определялось медленное восстановление поведенческих реакций, но оно было неполным.

На 3-и сут опыта при гистологическом исследовании препаратов поясничного утолщения спинного мозга, наиболее выраженные изменения отмечались в передних рогах – хроматолиз цитоплазмы, пикноз ядер, растворение глыбок базофильного вещества Ниссля в нейронах с превращением их в клетки-тени. Встречались также неизменённые и гипер-хромные нейроны. Определялась нейронофа-гия, перицеллюлярный и периваскулярный отёк в белом веществе.

На 7-е сут наблюдения в центральной зоне ишемического очага определялись деструктивные изменения в нейронах, а в перифокальной зоне отмечались также неповреждённые нейроны. Увеличивалось содержание астроцитов с признаками их гипертрофии, наблюдалась активизация микроглии, появлялись макрофаги.

Морфологические изменения в тканях спинного мозга на 14-е сут опыта были сходными с таковыми, описанными на 7-е сут. В то же время в зоне ишемии сформировался глиосоединительнотканный рубец, который наблюдался до 30-х сут.

Результаты количественного исследования препаратов спинного мозга показали, что число нормальных нейронов на 7-е сут опыта существенно уменьшилось, а нейронов с хро- матолизом и клеток-теней увеличилось по сравнению с предыдущим сроком наблюдения. Напротив, на 14-е сут содержание нормальных нейронов, а также число кровеносных сосудов на 30-е сут достоверно увеличилось по отношению к предыдущим срокам эксперимента (см. таблицу).

У всех животных, леченных рекомбинантным ЭП (2-я серия экспериментов), наблюдалась ранняя активизация поведения. Так, уже через 36 ч после моделирования ишемии спинного мозга и в последующие сроки наблюдения (3, 7, 14, 30-е сут) у них отсутствовали неврологические расстройства и они активно обращались к пище и воде.

При исследовании гистологических препаратов спинного мозга на 3-и и 7-е сут опыта, а также в последующие сроки наблюдения (14, 30-е сут) отмечалась хорошая сохранность нейронов, среди которых встречались отдельные гиперхромные клетки и лишь единичные были с признаками набухания и сморщивания. Определялась активная пролиферация глиоцитов и эндотелиоцитов капилляров, артериол, полнокровие сосудов.

Динамика количественных изменений исследованных показателей в ишемизированных тканях спинного мозга крыс различных серий опытов (М ± m)

Исследованный показатель (на условной единице площади)	Серия опыта	Сроки наблюдения (сут)
		3-и	7-е	14-е	30-е
	1-я	30,2 ± 2,1	24,3 ± 1,1 *	27,8 ± 1,3 *	29,9 ± 2,5
Количество	2-я	69,3 ± 3,1 **	81,1 ± 2,8 *,**	87,7 ± 2,5 **	90,8 ± 3,5 **
нормальных нейронов	3-я	59,1 ± 1,7 **,****	65,2 ± 1,3 *,**,****	72,3 ± 2,1 *,**,****	81,4 ± 2,6 *,**,****
	4-я	80,3 ± 1,8 **,***	88,2 ± 1,1 ’ ’	95,4 ± 2,3 ’ ’	99,1 ± 2,2 ’
	1-я	29,3 ± 0,6	36,4 ± 0,9 *	43,6 ± 2,1 *	53,8 ± 1,2 *
Число нейронов	2-я	25,2 ± 0,4 **	20,1 ± 0,8 *,**	17,1 ± 0,5* **	12,2 ± 0,3 *,**
с хроматолизом	3-я	27,4 ± 0,7 **,****	25,2 ± 0,3 *,**,****	20,1 ± 0,4 *,**,****	16,3 ± 0,3 *,**,****
	4-я	14,2 ± 0,8 **,***	12,1 ± 0,5 *,**,***	10,1 ± 0,3 *,**,***	7,0 ± 0,2 *,**,***
	1-я	36,2 ± 2,3	58,1 ± 2,5 *	63,8 ± 2,8	67,9 ± 2,2
	2-я	15,2 ± 0,3 **	10,1 ± 0,2 *,**	8,3 ± 0,4 *,**	3,8 ± 0,5 *,**
Число клеток-теней	3-я	19,8 ± 0,2 **,****	15,7 ± 0,3 *,**,****	10,6 ± 0,3 *,**,****	5,9 ± 0,6 *,**,****
	4-я	9,3 ± 0,1 **,***	6,2 ± 0,2 *,**,***	5,2 ± 0,4 **,***	2,1 ± 0,3 *,**,***
	1-я	4,3 ± 0,2	6,2±0,4	8,1 ± 0,7	10,2 ± 0,6 *
Количество мелких	2-я	7,9 ± 0,1 **	11,9 ± 0,2 *,**	16,8 ± 0,5 *,**	17,3 ± 0,3 **
кровеносных сосудов	3-я	9,8 ± °,4**.....	15,9 ± 0,3 *,**,****	20,8 ± 0,6 *,**,****	25,9 ± 0,6 *,**,****
	4-я	16,7 ± 0,5 ,	24,8 ± 0,4 *,**,***	33,9 ± 0,7 ’ ’	34,7 ± 0,6 **,***

Примечание. 1-я серия опыта - модель ишемии спинного мозга (группа сравнения); 2-я серия опыта -модель ишемии спинного мозга, леченная рекомбинантным ЭП; 3-я серия опыта - модель ишемии спинного мозга, леченная лазерным излучением; 4-я серия опыта - модель ишемии спинного мозга, леченная лазерным излучением в сочетании с рекомбинантным ЭП; * - p < 0,05 по сравнению с предыдущим сроком опыта в каждой серии; ** - p < 0,05 по отношению к 1-й серии опыта; *** - p < 0,05 по сравнению со 2-й и 3-й серией опытов; **** - p < 0,05 по сравнению со 2-й серией опыта.

Результаты морфометрического исследования препаратов спинного мозга показали (см. таблицу), что содержание нормальных нейронов, в зависимости от сроков опытов, увеличивалось незначительно, за исключением 7-х сут, а число нейронов с хроматолизом на 7, 14, 30-е сут существенно уменьшалось. Наряду с этим, число клеток-теней тоже уменьшалось, причём на 7-е сут достоверно, по сравнению с 3-ми сут. Количество кровеносных сосудов достоверно увеличивалось на 7-е и 14-е сут опытов. Кроме того, содержание нормальных нейронов и кровеносных сосудов было значительно больше, а число нейронов с хроматолизом и клеток-теней – меньше на всех сроках экспериментов по сравнению с 1-й серией опыта (модель ишемии спинного мозга без лечения).

У животных с моделью ишемии спинного мозга, корригированной лазерным воздействием (3-я серия опытов), поведенческие реакции и моторные функции медленно восстанавливались, начиная с 3-х сут эксперимента.

При гистологическом исследовании препаратов спинного мозга отмечались деструктивные изменения ядер и цитоплазмы отдельных нейронов, встречались клетки-тени. Определялась также пролиферация глиоцитов и эндотелиоцитов капилляров, полнокровие сосудов.

Данные морфологические изменения сохранялись до 14-х сут опытов. В это время, а также на 30-е сут экспериментов регистрировалась хорошая сохранность нейронов, лишь отдельные из них находились в состоянии набухания и сморщивания. Наблюдалась пролиферация глиоцитов, а также эндотелио-цитов капилляров и артериол, полнокровие сосудов, встречались чаще неповреждённые нервные волокна.

Результаты морфометрического исследования препаратов спинного мозга показали (см. таблицу), что количество нормальных нейронов достоверно увеличивалось с 7-х до 30-х сут. Наряду с этим, с 7-х сут и в последующие сроки опытов число клеток-теней и нейронов с хроматолизом уменьшалось, а содержание кровеносных сосудов – увеличивалось. Кроме этого, количество нормальных нейронов и кровеносных сосудов было значительно больше, а количество нейронов с хроматолизом и клеток-теней – меньше на всех сроках опытов по сравнению с 1-й серией эксперимента. В свою очередь, число нормальных нейронов было меньше, а содержание нейронов с хроматолизом, кровеносных сосудов и клеток-теней – больше на всех сроках опытов по сравнению со 2-й серией эксперимента.

Клиническая картина у животных с моделью ишемии спинного мозга, леченной рекомбинантным ЭП в сочетании с лазерным облучением (4-я серия опытов), начиная с 1-х сут после операции, характеризовалась регрессом неврологических расстройств и восстановлением поведенческих реакций.

При гистологическом исследовании в препаратах спинного мозга на 3, 7, 14 и 30-е сут опытов определялись хорошо сохранившиеся нейроны, среди которых лишь единичные находились в состоянии набухания и сморщивания. Отмечалась выраженная пролиферация глиоцитов, эндотелиоцитов капилляров и артериол с образованием новых полнокровных сосудов.

Результаты количественного исследования препаратов спинного мозга показали (см. таблицу), что число нормальных нейронов и кровеносных сосудов достоверно увеличивалось, начиная с 7-х сут опытов, а содержание нейронов с хроматолизом и клеток-теней – уменьшалось. В то же время количество нормальных нейронов и кровеносных сосудов было достоверно больше, а число нейронов с хроматолизом и клеток-теней – меньше на всех сроках наблюдения по сравнению с 1-й серией опыта. Наряду с этим, содержание нормальных нейронов и кровеносных сосудов было значительно больше, а число нейронов с хроматолизом и клеток-теней – меньше по отношению к 2-й и 3-й серии опытов на всех сроках наблюдения.

Данные изменения можно объяснить тем, что ЭП обладает антиапоптотическим и анти-гипоксическим действием, стимулирует ангио- и нейрогенез [2, 3, 5, 6], а воздействие лазерного излучения инфракрасного диапазона, глубоко проникающего в ткани, способствует усилению микроциркуляции, повышению функциональной активности различных клеток, включая эндотелиоциты сосудов, что приводит к активации неоангиогенеза в облучаемых тканях [8].

Заключение. Результаты исследования свидетельствуют, что применение лазерного излучения в сочетании с рекомбинантным ЭП, как одного из способов лечения экспериментальной ишемии спинного мозга у крыс, в сравнении с другими методами (только лазерное облучение или только введение рекомбинантного ЭП), способствует на ранних сроках опытов более выраженному предотвращению деструктивных изменений в нейронах, усиливает пролиферацию эндотелиоцитов сосудов с образованием нового кровеносного русла. Это сопровождается в динамике наблюдения более ранним регрессом и исчезновением неврологических расстройств, восстановлением поведенческих реакций у животных.