Пероксидаза печеночницы благородной ( Hepatica nobilis)

Введение. Пероксидазы - ферменты класса оксидоредуктаз, катализирующие окисление с помощью Н2О2 в присутствии бензидина. Наиболее изучена пероксидаза из корней хрена, молекула которой состоит из одной полипептидной цепи (308 аминокислотных остатков), связанной ковалентно с 8-ю олигосахаридными цепями. Пероксидазы существует в виде нескольких форм (изоферментов), состав и соотношение между которыми зависит от состояния и вида растения (Андреева, 1988).

Пероксидаза - гликопротеид, для которого носителем соответствующей изменчивости могут быть и углеводные компоненты. Такой компонент, даже небольшой по массе, может сообщать молекуле качественно новое состояние и регулировать отношение фермента к различным изменениям среды (pH, температуре, посторонние примеси и др.). Показано и доказано, что углеводная часть придает белку гораздо большую специфичность. Это своего рода векторные группы протеидов, которые «узнают» участки других структур, иные макромолекулы и поверхность клеток (Строев, 1986). В связи с этим представляют интерес данные Несселя и Мэдера (Nessel, Mader, 1977) о том, что кислые пероксидазы, как биохимические соединения, занимают особые положения, а содержание углеводов у них достигает примерно 20%.

Реакции, катализируемые пероксидазой, характеризуются переносом водорода от молекулы субстрата к перекисям, в результате чего возникают радикалы субстратов, являющиеся сильнореакционными соединениями. Большинство субстратов этого фермента - соединения фенольной природы (бензидин). Окисляясь до хинонов, они обладают сильным окислительно-восстановительным действием. Фенолы могут также ковалентно связываться с молекулой пероксидазы, изменяя ее каталитическое действие (Srivastava, Huystee, 1977). Особенности строения молекулы и возможности ее изменения играют немаловажную роль при активации индивидуальных изопероксидаз.

Пероксидаза - двухкомпонентный фермент, представляющий собой сочетание активной группы в активном центре, вступающей в химическое взаимодействие с субстратами, и белкового «носителя», усиливающего каталитическое действие этой группы. Это глобулярный белок диаметром 50 A (Clementi, Palade, 1969), который содержит около 43% а-спиральных участков в составе белковой части молекулы (Strickland, 1968). По номенклатуре ферментов, принятой на Международном биохимическом съезде в 1979 году, пероксидаза -фермент, действующий на перекись водорода в качестве акцептора. Единственный подподкласс (1.11.1) составляют пероксидазы, где под кодовым номером семь стоит истинная пероксидаза-донор: Нг СЬ -оксидоредуктаза (КФ 1.11.1.7), что относится к растительным и животным пероксидазам.

Методика. В экспериментальной программе по исследованию пероксидазы печеночницы благородной (Hepatica nobilis} был применён многоступенчатый подход, а именно:

• 1)    выделение пероксидазы из тканей растения;

• 2)    очистка полученного экстракта;

• 3)    определение содержания активного фермента;

• 4)    расчёт ферментативных параметров;

• 5)    анализ и обсуждение полученных параметров.

Поиск оптимальных условий для проведения каталитической реакции требовал исследования модельной ферментативной системы: пероксидаза печеночницы, бензидин (5-10"3 М), при варьировании концентраций Н2О2 (2-8)-(10"4М) с шагом в единицу, t=25°C, pH 5,3.

Первый этап. Выделение фермента пероксидаза печеночницы благородной (Hepatica nobilis} из биотканей (листья и стебли растений). 4 г ткани растений печеночницы гомогенизировали в 10 мл 0,1 М фосфатного буфера (1 = 0,35 М), содержащего 1,5-10 М бензойной кислоты и 1-10 М аскорбиновой кислоты (pH 5,3). Гомогенат отжимали, оставляли на 15 мин при периодическом перемешивании, центрифугировали при 10000 об/мин в течение 15 минут. Осадок отбрасывали. К надосадочной жидкости добавляли сухой (NH4)2SO4 до 20% насыщения. Через 3 часа осадок собирали центрифугированием при 5000 об/мин, его отбрасывали, в над осадочной жидкости -пероксидаза.

Метод биуретовой реакции. Готовят биуретовый реактив, растворяя последовательно в мерной колбе на 250 мл 0,375 г CuSO₄-5H₂O и 1,5 г сегнетовой соли (KOOC-CHOH-COONa-4 Н₂О) в 150 мл воды. Приливают медленно при постоянном перемешивании 75 мг 10%-ного раствора гидроксида натрия и доводят содержимое до 250 мл водой. Биуретовый реактив не подлежит длительному хранению в стеклянной посуде.

Фосфатный буфер

3 часа

Надосадочная жидкость, содержащая пероксидазу

Рис. 1. Схема выделения и очистки пероксидазы из биоматериала печеночницы благородной (Hepatica nobiUs)

по методу В.Д. Анисимова и Т.Б. Кастальевой (1978)

Далее определяли важнейшие ферментативные параметры - Км и V_max. Для этого изучали кинетику хода биокаталитической реакции по изменению величины оптической плотности (D) во времени (т) для изучаемой системы. В качестве примера представлены зависимости D~t для водного раствора пероксидазы, входящего в состав изучаемой системы (рис. 2).

D

1,05 ^ 1,00 -0,95 2 0,90 -0,85 -0,80 -0,75 -0,70 -0,650,60 2 0,55 -0,50 -0,45 -0,40 -0,35 -0,30 -0,25 2 0,20 -0,15 -0,1 о -

т, с

Рис. 2. Зависимости «D-т» для изучаемой системы при варьировании концентрации пероксида водорода (2-8)-(10"4М) с шагом в единицу:

1: 2-10'⁴М; 2; 310"⁴М; 3: 4-10 ⁴М; 4; 5-10"⁴М; 5: 6-10"⁴М; 6: 7-10"⁴М; 7: 8-10 ⁴М

На втором этапе работы определены кинетические параметры каталитической активности пероксидазы в изучаемой системе: бензидин (510'3 М), при варьировании концентраций Н2О2 (2-8)-(10~4М).

Результаты и обсуждение. На основе кинетических зависимостей D-т для изучаемой системы (рис. 2) рассчитаны начальные скорости (Vo) пероксидазозависимых ферментативных реакций (Vo), далее проведено спрямление в координатах двойных братных величин: 1/V и 1/[S] (координатах Лайнуивера-Берка) (рис. 3).

Рис. 3 . Спрямление кинетических зависимостей в координатах двойных обратных величин - координатах Лайнуивера-Берка (1/V - 1/[S]) для изучаемой системы

-33-

По отработанной схеме построены спрямленные кинетические зависимости в координатах Лайнуивера-Берка (рис. 3) и рассчитаны параметры Км и Vmax; Км = 2,23*10"3M;Vmax = 9, 52*10"3с"1.

Заключение. Экспериментально определенные значения ферментативных параметров - Км и V_max - для исчезающего вида печеночницы благородной находятся в полном соответствии с данными литературы (Лапина, Лихуша, 2010). Это позволяет считать пероксидазу печеночницы благородной тестовым ферментом при изучении разного рода (благоприятных и неблагоприятных) воздействий на экологическое состояние лесопарковых зон.