Пероксидазная активность гемоглобина (в присутствии GSH) в лизатах эритроцитов беременных женщин с г-6-фд дефицитом при воздействии электрического поля высокой напряженности

Электронный журнал «Вестник Новосибирского государственного педагогического университета» 6(16) 2013                                                   ISSN 2226-3365

Все права защищены

6(16) 2013

ISSN 2226-3365

В другой работе было установлено, что малые дозы воздействия электрического поля высокой напряженности (до 30 кВ/м, 5 час. эксп.) приводят к повышению активности ГП, а большие дозы (более 50 кВ/м, 5 час. эксп.) к подавлению ГП активности, окислительной модификации гемоглобина (накопление метгемоглобина), ускорению процесса гемо-лиза, накоплению продуктов реагирующих с тиоб-арбитуровой кислотой [2]. Однако вопрос о влиянии высоких доз воздействия электрических полей на пероксидазную активность гемоглобина (в присутствии GSH) не рассматривался.

Кроме того, нам представляется интересным рассмотрение влияния электрического поля высокой напряженности (ЭПВН) на изменение активности глутатионпероксидазы и показателей окислительной модификации гемоглобина и эритроцитов беременных женщин, носителей гена недостаточности энзима глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФД). Это важно по двум причинам. Во-первых, эта патология широко распространена в Азербайджане. Во-вторых, при этой патологии имеет место не только активация перекисного окисления липидов (ПОЛ) мембран эритроцитов и склонность к гемолизу, но и нарушение сопряженного с углеводным обменом метаболизма селенэнзима ГП, важного эритроцтар-ного антиоксидантного (АО) фактора защиты гемоглобина и эритроцитов от окислительной деструкции.

Целью настоящей работы является установление возможной связи между содержанием селена в гемоглобине и пероксидазной активностью гемоглобина при воздействии электрического поля высокой напряженности на лизаты эритроцитов беременных женщин на начальных и поздних сроках бе- ременности, как в норме, так и у носителей дефицита гена Г-6-ФД.

Материалы и методы.

Исследовали донорскую кровь женщин-волонтеров детородного возраста (n=30), кровь носителей дефицита энзима Г-6-ФД (n=32), беременных женщин (n=28) (начальные (n=18) и поздние (n=10) сроки беременности) и женщин носителей гена дефицита Г-6-ФД (n=16) (начальные (n=8) и поздние (n=8) сроки беременности). Волонтеры и беременные женщины не получали витаминноминеральные комплексы, способные повлиять на уровень селена в крови.

Компоненты крови выделяли стандартным методом центрифугирования [3]. Получение гемоглобиновых фракций осуществляли гель-хроматографическим способом, как описано в ранних публикациях [1].

Накопление метгемоглобина (MetHb) оценивали по полуэмпирическим формулам предложенным Szebeni J. et al. [4]. Активность глутатионпероксидазы в лизатах эритроцитов определяли по методу Моина [5]. Содержание селена в исследуемых образцах (лизаты эритроцитов и др.) определяли флуо-риметрически с применением специфического селенчувствительного реагента – 2,3’-диаминонафталина [6]. Интенсивность окислительных процессов оценивали по накоплению продуктов реагирующих с тиобарбиту-ровой кислотой (ТБК) [7]. Содержание гемоглобина в лизатах и элюатах определяли стандартным цианметгемоглобиновым методом [8]. Отмытые суспензии эритроцитов разделялись на две части: контрольные и опытные, подвергаемые влиянию электрического поля промышленной частоты высокой напряженности (50 кВ/м, 8 час. экспозиция), в которых определяли содержание селена и активность энзима ГП. Опыты проведены в

Все права защищены

6(16) 2013

ISSN 2226-3365

трехкратной повторности. Статистическая обработка осуществлялась с применением t-критерия Стъюдента [9].

Результаты и их обсуждение.

Ранее нами было установлено, что содержание селена в лизатах эритроцитов у беременных женщин на начальных сроках беременности близок к контрольному уровню, но на поздних сроках беременности уменьшается в ≈ 1,7-2 раза. Активность ГП в лизатах эритроцитов у беременных женщин на начальных сроках беременности составляет ≈ 285 ± 20 мкМоль GSH/мин на г Hb, а на поздних сроках беременности глутатионперокси-дазная активность лизатов эритроцитов уменьшается на ≈ 20 % [1].

В настоящей работе было выявлено, что содержание селена в лизатах эритроцитов у беременных женщин на начальных сроках беременности составляет 0,090 ± 0,026 мкг/мл, а к концу срока беременности уменьшается в ≈ 1,7 раза, что касается активности ГП, то она на начальных сроках беременности равно ≈ 380 ± 25 мкМоль GSH/мин на г Hb, но к концу срока беременности изменяется незначительно (≈ 15 %). У беременных женщин носителей гена дефицита Г-6-ФД содержание селена в лизатах эритроцитов уменьшается на ≈ 20 %, в сравнении со здоровыми женщинами, а активность ГП в лизатах эритроцитов в течение беременности уменьшается на 30-50 % по сравнению с контролем (волонтеры и нормально беременные женщины) (табл. 1).

Таблица 1

Содержание селена и активность ГП энзима в лизатах эритроцитов женщин в норме и в различные сроки беременности

	Лизаты эритроцитов
	Se, мкг/мл	ГП, мкМоль GSH/мин на 1г Hb
Доноры	0,093 ± 0,027
Беременные женщины (нач. срок берем.)	0,090 ± 0,026	380 ± 25
Беременные женщины (позд. срок берем.)	0,053 ± 0,021	323 ± 21
Беременные женщины носители гена дефицита Г-6-ФД (нач. срок берем.)	0,075 ± 0,020	286 ± 23
Беременные женщины носители гена дефицита Г-6-ФД (позд. срок берем.)	0,045 ± 0,022	232 ± 20

При воздействии электрического поля высокой напряженности (50 кВ/м, 8 час. экспозиция) оказалось, что эритроциты у беременных женщин на поздних сроках беременности менее устойчивы к индуцированному полем окислению, чем контрольные образцы, и у беременных женщин в случае дефицита Г-6-ФД это свойство еще более выражено. Так, накопление активных продуктов реагирующих с ТБК в рассмотренных образцах, и

Все права защищены

6(16) 2013

ISSN 2226-3365

особенно для случая дефицита энзима Г-6-ФД, а также у беременных женщин на позд- них сроках беременности увеличивается в 1,5-2 раза (рис. 1 а, б).

а, Начальные сроки беременности б. Поздние сроки беременности

25 -

20 -

10 -

20      40      60 S0

MUHVTM К, волонтеры           —•— К, нач.ср.берем.

К, Г-б-ФД нач.ср.берем. —*— ЭП, нач.ср.берем. ЭП, Г-б-ФД нач.ср.берем.

МИНУТЫ

К, волонтеры            —О— К, поя.ср.берем.

К, Г-б-ФД поя.ср.берем. —6— ЭП. поя.ср.берем.

ЭП, Г-б-ФД поя.ср.берем.

Рис. 1 (а, б) Кинетика накопления ТБК активных продуктов в суспензии эритроцитов нормально беременных женщин и женщин носителей гена дефицита Г-б-ФД при воздействии электрического поля (модель аскорбатзависимого ПОЛ: 10’4 М FeSO< + 10'4 М аскорбиновая кислота + 2 мл суспензии эритроцитов, 25° С) (К - контроль, ЭП - электрическое поле)

Сравнивая кривые накопления метгемоглобина и гемолиза при воздействии электрического поля пришли к выводу, что кривая накопления MetHb имеет более крутую характеристику, что косвенно свидетельствует о том, что окислительная деградация эритроцитов начинается с окисления самого гемоглобина. Наибольшую склонность к окислению проявляют эритроциты (как сам гемоглобин, так и мембранные структуры) с дефицитом энзима Г-6-ФД, беременных жен- щин на поздних сроках беременности, как нормальных, так и носителей патологичных генов Г-6-ФД (рис. 2 а, б).

Для установления возможной связи между содержанием селена в гемоглобиновой фракции и ее пероксидазной активностью произведено гель-хроматографическое разделение селенопротеиновых фракций в лизатах у женщин на начальных и поздних сроках беременности без и с патологией Г-6-ФД.

Все права защищены

6(16) 2013

ISSN 2226-3365

Рис. 2 (а, б) Накопление MetHb и гемолиз в суспензии эритроцитов при воздействии электрического поля (50 кВ/м, 5 час. зксп.)

1 - контроль; 2 - начальный срок беременности; 3 - контроль-Г-б-ФД; 4 - поздний срок беременности; 5 - Г-6-ФД нач. ср. берем.; б - Г-б-ФД позд. ср. берем.

Сравнительное рассмотрение распред-ления содержания селена, активности ГП (в том числе и квази-ГП) лизатов эритроцитов у женщин на начальных и поздних сроках беременности показывает (табл. 2), что в ходе беременности происходит некоторое снижение содержания селена и активности ГП, как в неокрашенных (содержащих ГП) фракциях, так и окрашенных (содержащих гемоглобин) фракциях. Однако уменьшение содержания селена и активности ГП в неокрашенных фракциях незначительно (≈ 10 %), в окрашенных фракциях содержание селена падает в ≈ 2 раза, а пероксидазная активность гемоглобина в присутствии глутатиона падает на ≈ 45 %. Для случая беременных женщин с патологией Г-6-ФД было установлено, что содержание селена и активности ГП в неокрашенных фракциях падает ≈ 8 % и 40 % соответственно, в окрашенных фракциях содержание селена падает в ≈ 2,2 раза, а перок- сидазная активность гемоглобина в присутствии глутатиона падает на ≈ 60 %. Это очевидно связано с тем, что в лизатах гемоглобин составляет более 95 % общего протеина, в то время как содержание белка в неокрашенных фракциях очень низко (≈ 0,01 – 0,05 мг/мл), а в окрашенных фракциях содержание гемоглобина максимально.

Данные представленные в таблице 2 показывают, что при воздействии ЭПВН наблюдается снижение содержания селена и активности ГП, как в неокрашенных, так и окрашенных фракциях в обоих случаях (т.е. беременные женщины без и с патологией Г-6-ФД). В обоих случаях это уменьшение более заметно для лизатов эритроцитов у женщин на поздних сроках беременности по сравнению с начальными сроками беременности. Сопоставление содержания селена в гель-хроматографических профилях, не подвергнутых и подвергнутых влиянию ЭПВН, эрит-

Все права защищены

6(16) 2013

ISSN 2226-3365

роцитарных лизатов показывает, что деструктивное окисление лизатов эритроцитов обусловливает определенную миграцию селена из нижних окрашенных фракций в верхние, т.е. окислительная деградация гемоглобина сопровождается его олигомерной фрагментацией.

Сравнивая изменения в спектре гель-хроматографических показателей лизатов эритроцитов у женщин на начальных и поздних сроках беременности, нетрудно заметить, что влияние ЭПВН на лизаты эритроцитов у женщин на поздних сроках беременности приводит к бóльшим сдвигам в показателях, чем для лизатов эритроцитов у женщин на начальных сроках беременности, т.е. имеет место бóльшее снижение ГП активности, как самого ГП энзима, так и гемоглобина (квазиГП), и по олигомерной фрагментации гемоглобина, прослеживается миграция селена из нижних зон в верхние. Для случая беременных женщин с патологией Г-6-ФД, учитывая, что изначально содержание селена и активность ГП были низкими по сравнению с нормально беременными женщинами, наблюдается еще больший сдвиг в показателях.

Таблица 2

Удельное содержание селена (мкг/ на г Hb) и активность ГП (мкмоль GSH/мин на г Hb) в гель-хроматографических фракциях лизатов эритроцитов у женщин на н.с.б. и п.с.б.

Лизаты эритроцитов беременных женщин (n=4)	Фракции
	1-5 неокрашенные		6-7 окрашенные		8-10 окрашенные		11-12 окрашенные
	ГП	Se	ГП	Se	ГП	Se	ГП	Se
Нач.ср.берем	574 ± 20	1,76 ± 0,09	83 ± 8	0,185 ± 0,014	138 ± 10	0,136 ± 0,013	следы	следы
Позд.ср.берем	517 ± 15	1,62 ± 0,08	75 ± 5	0,147 ± 0,012	124 ± 12	0,083 ± 0,015	следы	следы
Г-6-ФД Нач.ср.берем.	478 ± 22	1,50 ± 0,07	76 ± 8	0,158 ± 0,013	126 ± 10	0,116 ± 0,014	следы	следы
Г-6-ФД Позд.ср.берем.	356 ± 21	1,43 ± 0,06	53 ± 6	0,122 ± 0,007	96 ± 12	0,074 ± 0,006	следы	следы
После воздействия ЭПВН (50 кВ/м, 8 час. эксп.)
Нач.ср.берем	345 ± 20	1,27 ± 0,05	33 ± 7	0,134 ± 0,012	56 ± 10	0,063 ± 0,008	следы	следы
Позд.ср.берем	310 ± 14	1,10 ± 0,04	30 ± 4	0,093 ± 0,010	50 ± 12	0,047 ± 0,007	следы	следы
Г-6-ФД Нач.ср.берем.	317 ± 24	1,08 ± 0,08	16 ± 7	0,112 ± 0,008	23 ± 10	0,051 ± 0,007	следы	следы
Г-6-ФД Позд.ср.берем.	285 ± 22	0,96 ± 0,05	12 ± 4	0,071 ± 0,007	46 ± 12	0,036 ± 0,005	следы	следы

Таким образом, мы можем заключить, что повреждающий окислительный эффект ЭПВН для гемоглобина более выражен для лизатов эритроцитов у женщин на поздних сроках беременности, которые обладают более сниженным АО статусом и содержанием

Все права защищены

6(16) 2013

ISSN 2226-3365

селена, чем лизаты эритроцитов у женщин на начальных сроках беременности. Кроме того, в лизате эритроцитов, при длительной экспозиции в ЭПВН, происходит угнетение пероксидазной активности, как самого ГП энзима, так и гемоглобина. Потеря пероксидазной активности гемоглобина является следствием окислительной деструкции гемоглобина. Эти процессы более заметны для случая лизатов эритроцитов у беременных женщин с патологией Г-6-ФД, обладающих меньшим проти-воокислительным потенциалом по сравнению с нормально обеспеченными.

Таким образом, в рамках данной работы показано, что несмотря на значительное уменьшение содержания селена в лизатах эритроцитов у беременных женщин в обоих случаях, как на начальных, так и поздних сроках беременности, активность истинного ГП энзима падает незначительно, в то время как пероксидазная активность гемоглобина угнетается существенно, что свидетельствует об определенной связи между содержанием селена в гемоглобиновых фракциях и пероксидазной активностью гемоглобина.