Пероксидазозависимый иммунитет гороха к фузариозу

индукции устойчивости и , следовательно , к раннему ограничению размера некроза . Таким образом , главная роль пероксидазы клетки состоит в скорости роста некроза и в образовании продукта как « индуцирующего агента », который после движения к соседним клеткам вызывает к действию механизм устойчивости .

Задача данной работы – изучить уровень активности пероксидазной системы корней гороха различных сортов при механическом повреждении , а также изменение активности пероксидазы при заражении Fusarium oxysporum сорта устойчивого и неустойчивого к грибным инфекциям .

Целью данной работы является сравнение активности пероксидазной системы , измеренной методом хемилюминесценции , при механическом повреждении корней гороха и активности пероксидазы , полученной методом колориметрии , при заражении грибом Fusarium oxysporum проростков различных сортов гороха (Pisum sativum).

Материалы и методы

Изучена пероксидазная активность четырехдневных проростков следующих сортов гороха, различающихся устойчивостью к корневым гнилям: устойчивые – Орлус, Зубр , Норд, Демон, Неручь, ПСС- 21507; среднеустойчивый – Батрак: средневосприимчивый – Спрут -2; восприимчивые – Смарагд, Орловчанин. Салара, Колт, П-2150. Измеряли увеличенную люминолом хемилюминесценцию (ХЛ) образцов на люминометре 1251 LKB-Wallac, Ш веция. Для этого три отрезка корня длиной 1 см каждый взвешивали и затем подвергали механическому повреждению с помощью прокатывания металлическим цилиндром весом 100 г. Обработанные таким образом корни помещали в кюветы, содержащие по 1 мл инкубационной среды: 400 мМ К-Na-фосфатного буфера (рН 7,4), 250 мМ сахарозы, 10-6 М люминола (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазинедион, Serva). Люминол растворяли в диметилсульфоксиде в концентрации 10-2 М, затем разбавляли 400 мМ К-Na-фосфатным буфером (рН 7,4) до концентрации 10-4 М. В каждую кювету добавляли 10 мкл этого раствора. Перед измерением ХЛ кюветы инкубировали 10 мин при 25о С. Определяли величину суммарного свечения за 10 с в образцах поврежденных корней, затем вычитали величину свечения буфера без растительной ткани и рассчитывали величину свечения на 1 г веса корней. Результаты представлены на диаграммах.

Активность пероксидазы в ответ на заражение возбудителем корневых гнилей изучена колориметрическим методом на    сортах, различающихся устойчивостью к фузариозу: Метод основан на определении скорости реакции окисления бензидина до образования синего продукта окисления определенной концентрации, заранее устанавливаемой на фотоэлектроколориметре. После добавления бензидина сразу включали секундомер и записывали его показания после того, как оптическая плотность реакционной смеси на длине волны 490 нм достигала 0.15. Активность пероксидазы рассчитывали по формуле:

, D ■ a ■ б ■ в A =

с ■ t

, где a – степень разбавления навески в экстракте, мл/г, б – степень разбавления экстракта, взятого для реакции, б=(1.95 мл + 0.05 мл)/0.05 мл =40; в – степень разбавления экстракта в реакционной смеси, в=(1.95 мл + 0.05 мл + 1 мл + 1 мл)/0.05 мл = 80c – длина оптического пути в кювете, с = 1 см, D – оптическая плотность раствора, D=0.15, t – время в секундах, требующееся реакционной смеси для достижения оптической плотности D=0.15.

Результаты и обсуждение

№1  №2  №3 №4  №5  №6  №7

А

1000 0

№8 №9 №10 №11 №12 №13

В

Рисунок 1 – Увеличенная люминолом хемилюминисценция поврежденных корней гороха различных сортов. По оси ординат – уровень хемилюминесценции в милливольтах

Каждый столбик диаграммы представляет собой среднее значение 10 измерений ± стандартное отклонение

А

№1. Орлус. – устойчивый к корневым гнилям

№2. Салара. – восприимчивый к корневым гнилям

№3. Спрут-2. – устойчивый к корневым гнилям

№4. Зубр – устойчивый к корневым гнилям.

№5. Норд. – среднеустойчивый к корневым гнилям

№6. Смарагд – восприимчивый к корневым гнилям

№7. Демон – устойчивый к корневым гнилям

Б

№8. Орловчанин. восприимчивый к корневым гнилям и аскохитозу

№9. Батрак. – восприимчивый к корневым гнилям

№10. Неручь – устойчивый к корневым гнилям

№11. ПСС-21507 – устойчив к корневым гнилям

№12. Колт – восприимчивый к аскохитозу

№13. П-2150-НЕ ФИКСИРУЕТ АЗОТ, восприимчивый к корневым гнилям.

Данные, представленные на рисунке 1, показывают, что устойчивые к корневым гнилям сорта гороха (№№1, 3, 4, 11) обладают повышенным уровнем активности пероксидазной системы , что выражается в увеличенных значениях люминолзависимой хемилюминисценции. Исключением является сорт Неручь (№10) с низким уровнем хемилюминесценции. Вероятно, устойчивость к корневым гнилям у этого сорта обеспечивается за счет других компонентов иммунной системы . У всех восприимчивых к заболеванию корневыми гнилями сортов гороха (№2, 6, 8, 9, 12) и линии П-2150, не фиксирующей азот, активность пероксидазной системы низкая.

У всех восприимчивых к заболеванию корневыми гнилями сортов гороха ( №№ 2, 6, 8, 9, 12) и линии П 2150, не фиксирующей азот , резко падает хемилюминисценция и при механическом повреждении .

Активность пероксидазы , измеренная колориметрически ( рис . 2), в норме у устойчивого сорта гороха Din. Dale составляет от 200 до 480 е . в течение 10 дней прорастания , а у восприимчивого сорта Смарагд ( рис . 4) всего от 90 до 170 е . Инфицирование Fusarium oxsysporum семян устойчивого сорта гороха Din. Dale приводит к резкому увеличению пероксидазной активности от 120 до 1000 у . е ., а затем резко падает к 8- му дню с дальнейшим плавным подъемом , что указывает на высокий иммунный статус устойчивого сорта .

У восприимчивого сорта Смарагд (рис. 3) инфицированные патогеном растения имеют активность пероксидазы в начале прорастания выше, чем у контрольного варианта почти в 2 раза, а затем уровень пероксидазной активности плавно понижается до 120 у.е , что указывает на низкий иммунный статус данного сорта.

Пероксидаза использует накопленные при работе супероксиддисмутазы ( СОД ) фенолы для лигнификации клеточных стенок , что приводит к образованию механического барьера на пути инфекции .

Растительные пероксидазы инактивируют вирусные и грибные патогены и участвуют в генерации синглетного кислорода ( Роговин и др .1987 ). Активность пероксидазы у устойчивого сорта Dun. Dale даже при заражении Fusarium oxsysporum выше в 2 раза , чем у восприимчивого сорта Смарагд .

Таким образом , реакция различных по устойчивости сортов гороха на действие некроза , возникающего при инфицировании патогеном , выражается лишь в абсолютных значениях активности пероксидазы , но закономерность реакции различных по устойчивости растений сохраняется , независимо от состояния иммунной системы клеток .

Рисунок 2 – Активность пероксидазы устойчивого сорта Dun. Dale: 1 – контроль, 2 – инфицированные Fusarium oxsysporum

Рисунок 3 – Активность пероксидазы сорта гороха Смарагд: 1 – контроль, 2 – инфицированные

Таким образом , установлена однотипная ответная реакция на механическое повреждение гороха и заражение грибной инфекцией : устойчивые сорта гороха к биогенному воздействию , оказались устойчивыми и к механическому повреждению , а восприимчивые к инфицированию оказались восприимчивыми к механическому повреждению .

Теоретический и научно - практический журнал . Основан в 2005 году

Адрес редакции: 302019, г. Орел, ул. Генерала Родина, 69.

Сдано в набор 14.10.2010

Подписано в печать 28.10.2010 Формат 60х84/8. Бумага офсетная.

Гарнитура Таймс.

Объём 12,5 усл. печ. л. Тираж 300 экз. Издательство Орел ГАУ, 302028, г. Орел, бульвар Победы, 19.

Лицензия ЛР№021325 от 23.02.1999 г.

Ж урнал рекомендован ВАК Минобрнауки России для публикаций научных работ, отражающих основное научное содержание кандидатских и докторских диссертаций

Содерж ание номера