Персонализированный подход к лечению колоректального рака

По данным ВОЗ, ежегодно в Мире регистрируется около 900 тыс. новых случаев колоректального рака (КРР) и более 400 тыс. смертей от этой патологи. В Европе показатели равны 370 тыс. и 200 тыс. соответственно [1]. В целом в европейских странах КРР составляет 13% в структуре всей онкологической заболеваемости. В Российской Федерации выявляется около 57 тыс. новых случаев заболевания в год, а в структуре онкологической заболеваемости КРР стабильно занимает 2-3-е место [2]. Не более 20% больных на момент установления диагноза имеют 1-11 стадии. У 40% регистрируется вовлечение в процесс регионарных лимфоузлов, а у каждого третьего диагностируются отдаленнее метастазы. Дополнительно к этому у 40-60% больных, которым были выполнены радикальные хирургические вмешательства, в процессе наблюдения наступает диссеминация процесса, что расширяет группу пациентов, требующих проведения лекарственной терапии. Мы впервые на основании оценки цитологических и гистологических характеристик опухолевых клеток определили патогенетически обоснованный выбор метода лечения колоректального рака. Был разработан и апробирован способ сравнительной оценки чувствительности опухолевых клеток к различным химиотерапевтическим агентам, что позволило оптимизировать схемы химиотерапевтического лечения новообразований ободочной и прямой кишки. С учетом патогенетических и молекулярных механизмов развития неопластического поражения толстой кишки.

Цель работы: оптимизировать схемы комбинированного лечения колоректального рака.

Задачи исследования: провести in vitro оценку влияния химио- и иммунотерапевтических средств на цитогенетические показатели культур клеток опухолевой эпителиальной ткани; обосновать включение в схему лекарственной терапии колоректального рака перспективные подходы оценки чувствительности к лекарственным препаратам опухолевых клеток с учетом их фенотипической и генотипической вариабельности.

Методы исследования: проведено цитологическое исследование препаратов биопсийного и операционного материала по методу Паппенгейма [3] 108 больных. Препараты фиксировали в течение 2 мин в растворе, приготовленном по методу Май-Грюнвальда [3], промывали водой, докрашивали смесью 0,1% раствора азур-эозина в течение 6 мин, краситель смывали водой, высушивали и исследовали с помощью микроскопа «Leica» при увеличении ×200 и ×400. Изучали клеточный состав, отмечали наличие дисплазии эпителиальной ткани кишечника. В стерильных условиях во время операции отобраны образцы опухолевой и нормальной ткани больных КРР, которая расположена на расстоянии 10 см от опухоли. Образцы ткани помещали в стерильную среду культивирования МЕМ (Hy-clone, Logan, UT) c добавлением 10% инактивированной эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (ЭС) и антибиотиков (на 1 мл среды пенициллина 100 Ед, цефазолина 5 Ед, канамицина 5 Ед, Sigma, St. Louis, MO). Образцы ткани помещали в стерильные флаконы со средой МЕМ (370С), ДНК-азой I (15 мкг/мл) и подвергали механической и ферментативной дезагрегации на шейкере при 100 об/мин в течение 20 мин при 370С [3]. Затем клетки центрифугировали в течение 10 мин при 1250 об/мин при 40С. Клетки помещали в 100 мм чашки для культивирования. Состав среды культивирования (Sigma): 6,16 мл среды МЕМ; натрий фосфатный буфер 7,5%; 1,6 мл ЭС; 0,08 мл L-глютамина; 0,08 мл 1% раствора антибиотиков. Клетки инкубировали в термостате при 370С в 5% атмосферой СО2. Колониеобразующую активность клеток оценивали стандартным методом [3]. Суспензии в концентрации 1×105 клеток в 20 мл МЕМ среде с 0,6% агарозы (Sigma) помещали в 100 мм чашки для культивирования. Клетки инкубировали в термостате при 370С в 5% атмосфере СО2 в течение 7 дней. Колониеобразующую активность рассчитывали по формуле: К/N×100%, где К – количество колоний на чашку, N – количество засеянных на чашку клеток. Суспензии первичных культур клеток в 90 мкл МЕМ среды помещали в 96-луночные иммунологические планшеты в концентрации 1×103 клеток на лунку и добавляли лекарственные препараты. В контрольном варианте в инкубационную среду с клетками добавляли деионизированную Н2О в объеме 10 мкл, соответствующему объему раствора лекарственного препарата. Клетки в планшетах инкубировали 24, 48, 72, 96 час. Оптическую плотность (ОП) клеток в МЕМ среде измеряли на UV- спектрофотометре Biospec-mini (Shimadzu, Япония) при длине волны 630 нм. Скорость роста клеток рассчитывали по формуле: R=exp(-t)≈∆N/N, где N – ОП суспензии клеток, необработанных химическим соединением, ∆N – ОП суспензии клеток, обработанных химическим соединением [3, 5]. Эксперименты проведены в трех повторностях. Анализ хромосомных аберраций выполняли стандартным методом [4]. Культуры клеток инкубировали в термостате при 370С в течение 48 час. Для блокирования митоза на стадии метафазы за 2 час до окончания инкубации первичных культур клеток в инкубационную среду добавляли 0.002 мкг/мл колхицина (Sigma). Затем клетки помещали в 0,75 М раствор КCl на 15 мин, после инкубации их фиксировали в растворе метилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1). В каждом приготовленном и окрашенном по методу Гимза препарате анализировали 100 метафаз при помощи микроскопа «Leica» при увеличении ×1000. Подсчитывали количество клеток с распознаваемыми без кариотипирования хромосомными аберрациями. Митотический индекс рассчитывали по формуле: МИ = М/К×100%, где М – количество делящихся клеток в популяции, К – общее количество клеток (не менее 1000) в популяции [5]. Эта же формула использовалась для вычисления количества анеупло-идных клеток.

Лекарственные препараты в экспериментах по оценки влияния на опухолевые клетки использовали в конечных концентрациях мкг/мл: 18 - 5-фтор-дезоксиурацил (5-ФУ), 0,43 - цисплатин (ЦП), 2 - то-мудекс (ТД), и иммуномодулятор 0,29 - лейковорин (ЛВ). После обработки препаратами клетки инкубировали в течение 48 час при 370С.

Выделение ДНК и РНК из клеток . К клеткам в буфере LST (29 мМ трис-HCl рН 8,0, 10 мМ NaCl, 1 мМ MgCl 2 , 0.25 М сахароза) добавляли равный объем буфера 4× TNLB (29 мМ трис-HCl рН 8,0, 10 мМ NaCl, 3 мМ MgCl 2 , 5% сахарозы). Суспензию клеток центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 мин. К клеткам дважды промытым буфером LST добавляли буфер TNE (10 мМ трис-HCl рН 8,0, 10 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА), 1% лаурилсульфат натрия и протеиназу К в конечной концентрации 100 мкг/мл. РНК из клеток выделяли согласно инструкции к набору TRIzol (Life Technologies, Inc.).

Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ПЦР-RT) [3, 4] . Продукты амплификации анализировали в 1% агарозном геле с добавлением 0,5 мкг/мл бромистого этидия (EtBr). Праймеры для реакции представлены в таблице 1.

Температуру отжига праймеров рассчитывали по формуле: 40С × (G+C)+20С × (A+T)–4. Состав инкубационной смеси объемом 30 мкл: 2 мкг РНК, 1 µl M-MulV (обратная транскриптаза, СибЭнзим), 300 нM (5,0 пмоль) прямого и обратного праймера, 0,1 µM (2,5 пмоль), 5,0 нM MgCl2, SYBR Green, 10 мM трис–HCl pH 8,0, 3,5 нМ TaqMan ДНК-полимеразы (Sigma), 200 µM каждого из четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов и 50 мM KCl. Циклы реакции: 250C в течение 5 мин; 40 циклов по 15 сек при 950C; 520C в течение 20 сек; 720C в течение 25 сек. Инкубационную смесь в конце реакции охлаждали до 40C.

Разделение ДНК проводили в 0,8% агарозном геле в ТАЕ буфере (40 мM трис–HCl pH 8,5, 5,71% ледяной уксусной кислоты, 0,04 мМ ЭДТА) в присутствии 0,5 мкг/мл EtBr. Электрофорез проводили при 10-15 В/см в течение 120 мин. Результаты протоколировали на BioRad. Данные тематических карт и экспериментальных работ, обрабатывали методами математической статистики. Статистический анализ результатов проводили с использованием методов описательной статистики, парного t -критерия Стьюдента и парного T-критерия Вилкоксона для двух попарно связанных выборок, непараметрического U-теста Манна-Уитни (Mann-Whitney U Test), метода линейного корреляционного анализа Пирсона. Результаты в большинстве таблиц, рисунков и в тексте представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (М±m) с указанием стандартного отклонения SD и величины выборки n. Различия или показатели связи считались статистически значимыми при p <0,05. Расчеты выполнены при помощи компьютерной программы Excel 2003.

Результаты исследования: путем случайной выборки из 68 больных с КРР отобран биопсийный материал у 10 больных с разными гистологическими морфотипами аденокорцином (низкодифференцированная, НД - 3, умереннодифференцированная, УД -6, высокодифференцированная, ВД - 1), которым в дальнейшем проводилось комбинированное лечение.

Таблица 1 Праймеры

Из биопсийного материала получены первичные культуры клеток, в которых определяли уровень мутагенеза, пролиферативной активности и резистентность к противоопухолевым препаратам. В первичных культурах клеток аденокарцином по сравнению с культурами нормальных эпителиальных клеток больше количество анеуплоидных клеток (соответственно от 2,8±0,2% до 15,2±0,2%, SD 0,36 и 1,87, 1,6±0,04%, SD 0,7; p< 0,05), клеток с хромосомными аберрациями (соответственно от 5,7±0,9 до 15,1±3,7%, SD 2,4 и 9,8, и 0,2±0,002%, SD 0,007; p< 0,05). Статистически не значимы уровни митотического индекса в культурах клеток, полученных из биоптатов аденокарцином и нормальных эпителиальных тканей (соответственно от 25,5±2,0% до 41,7±7,3, SD 4,5 и 17,9 и 22,3±0,3%, SD 0.6). Отсутствует корреляционная зависимость уровня клеток с хромосомными аберрациями (2,1±0,01%) и уровня митотического индекса (5,2±0,02%; r= 0,2; p> 0,05) в первичных культурах клеток ВД аденокарцином, основными характеристиками которых являются большое количество митозов и ядрышек в клетках. Корреляционная зависимость уровня клеток с хромосомными аберрациями (2,9±0,1%) и митотического индекса (36,6±0,2%; r=0.5; p<0,05) обнаружена в культурах клеток, полученных из УД аденокарцином, в которых есть перстневидные и атипичные клетки, некрозы, ядерный полиморфизм. Максимальный коэффициент корреляции между уровнем клеток с хромосомными аберрациями (5,6±0,02%) и митотическим индексом (20,8±0,2%; r=0,9; p<0,05) характерен для культур клеток НД аденокарцином с инвазивным ростом, массивными некрозами, большим количеством митозов, атипичными клетками и ядерным полиморфизмом. Основными типами хромосомных аберраций в опухолевых клетках являются дицентрические хромосомы (0.57±0.03%), парные и непарные хроматидные делеции (0,71±0,01%), количество которых в нормальных эпителиальных клетках соответственно 0,01±0,001% и 0,02±0,004%.

Результаты работы показали, что концентрации цитостатиков и иммуномодулирующего препарата, соответствующие их терапевтическим дозам, максимально эффективно снижают количество анеуплоид-ных клеток, клеток с хромосомными аберрациями и митотический индекс в первичных культурах клеток, полученных из высокодифференцированной аденокарциномы. Цисплатин, лейковорин и 5-фторурацил вызывают снижение количества анеуплоидных клеток в первичных культурах клеток, полученных из НД или УД аденокарцином. Максимально эффективное влияние на геномную стабильность и деление клеток всех подгрупп первичных культур клеток аденокарцином оказала комбинация 5-фторурацила с лейковорином. Необходимо отметить, что цисплатин, 5-фторурацил и их комбинации с лейковорином вызвали повышение в 1.4-1.8 раза количества клеток с хромосомными аберрациями в культурах клеток, полученных из УД аденокарцином. Первичные культуры клеток, полученные из аденокарцином с различной степенью дифференциа- ции, различаются не только по митотическому индексу, уровню клеток с повреждением хромосом, геномными аномалиями, но и колониеобразующей активностью. Анализ результатов показал, что 5-фторурацил, цисплатин, лейковорин, томудекс стимулируют колониеобразующую активность клеток, полученных из НД аденокарцином. Все терапевтические препараты, кроме лейковорина и томудекса не влияют на колониеобразующую активность клеток, полученных из УД аденокарцином. Лейковорин ингибирует колониеобразующую активность клеток, полученных из УД аденокарцином. Цисплатин и лейковорин стимулирует колониеобразующую активность клеток, полученных из ВД аденокарциномы. Динамика роста опухолевых клеток, обработанных препаратами in vitro, имеет индивидуальные особенности. Клетки первичных культур, полученных из НД аденокарцином, не чувствительны к цитотоксическому действию лекарственных препаратов. Исключением является высокая чувствительность к томудексу клеток, полученных из УД и ВД аденокарцином. Максимально чувствительными к цитотоксическому действию противоопухолевых препаратов являются клетки, полученные из ВД аденокарцином. Экспериментально выявлено, что комбинации противоопухолевых препаратов эффективнее подавляют развитие опухолевых клеток.

Таким образом, клетки первичных культур, полученные из аденокарцином с разной степенью дифференциации, различаются по чувствительности к лекарственным препаратам разных групп химических соединений. Гипермутагенез и снижение чувствительности клеток к цитостатическому действию противоопухолевых препаратов являются признаками мутаторно-го фенотипа клеток. Одной из причин развития КРР является появление клеток с мутаторным фенотипом, который возникает в результате соматических мутаций в генах системы репарации ошибочно спаренных оснований [3, 5]. В клетках, мутантных по гену hMSH6, высокая экспрессия белка Msh3, а в клетках, мутантных по гену hMSH2, не экспрессируются белки Msh3 и Msh6 [5]. Анализ продуктов ПЦР реакции свидетельствует о присутствии мутаций в генах hMSH6 (два пациента с УД и один пациент с ВД аденокарциномами) и hMSH2 (четыре пациента с УД аденокарциномой). В качестве контроля в анализе использованы праймеры к гену, продуктом которого является β-актин. Таким образом, высокая пролиферативная активность, геномная нестабильность, низкая чувствительность к противоопухолевым препаратам опухолевых клеток являются показателями отсутствия аллелей дикого типа MSH3 и MSH6 в соматических клетках. По результатам работы были сделаны следующие выводы: цитогенетические исследования опухолевых клеток эпителия толстой кишки, позволяют оценить воздействие химиотерапевтических и иммуномодулирующих препаратов, что является основанием для подбора эффективных схем комбинированного лечения больных колоректальным раком; цитогенетический анализ клеток позволяет изучать молекулярные механизмы развития колоректаль- ного рака и репарации ДНК, что необходимо при патогенетическом обосновании и оптимизации комбинированного метода лечения неопластического поражения толстого кишечника.