Перспектива снижения антибиотикорезистентности с помощью растительных лекарственных средств у Escherichia coli

Введение. Заболевания органов пищеварения занимает особое место среди других видов патологий молодняка сельскохозяйственных ^ивотных, в том числе и в хозяйствах занимающихся разведением и выращиванием крупного рогатого скота. Эта патология сопрово^дается серьезными экономическими потерями, что обусловлено паде^ом, выбраковкой, сни^ением среднесуточных привесов, расходами на лечение [1, 2].

Микробиологическая диагностика при массовых ^елудочно-кишечных заболеваниях новоро^денных телят с признаками диареи позволяет выявить микрофлору, участвующую в развитии патологического процесса. Чаще всего в качестве этиологического фактора выступает смешанная микрофлора. Патогенные и условно-патогенные Escherichia coli, играют зачастую главную роль в данном вопросе [3] .

Профилактика болезней молодняка затрудняется тем, что организм новоро^денного в силу морфофункциональных особенностей в раннем постнатальном периоде слабо приспособлен к неблагоприятным условиям окру^ающей среды [4].

Создание антимикробных препаратов является революционным в отношении лечения многих инфекционных заболеваний, однако их использование в медицинской и ветеринарной практике привело к появлению устойчивых штаммов и возникновению глобальной проблемы человечества -антибиотикорезистентности [5].

Несмотря на выработку мно^ественной резистентности и негативное влияние антимикробных препаратов на иммунный статус организма, использование антибиотиков остается одним из основных направлений фармакотерапии при массовых ^елудочно-кишечных заболеваниях с симптомокомплексом диареи [3, 6-8].

Многие ветеринарные специалисты используют средства растительного происхо^дения, нормализующие функциональные расстройства ^елудочного-кишечного тракта, однако их влияние на анитибиоткорезистентность микроорганизмов остается неизученным.

Разработка мер по преодолению устойчивости микроорганизмов к антибактериальным препаратам довольно актуальна, поэтому цель нашего исследования : изучить влияние некоторых факторов растительного происхо^дения на чувствительность Escherichia coli к антимикробным препаратам in vitro.

Условия, материалы и методы. Экспериментальные исследования выполнены в отделе микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГБНУ ДальЗНИВИ. Объект исследований – культуры Escherichia coli выделенные от телят с признаками острых кишечных инфекций.

Чувствительность к антимикробным препаратам изучали дискодиффузионным методом с применением стандартных коммерческих дисков с антибиотиками на среде Мюллера-Хинтона. Ряд антимикробных препаратов включал препараты группы пенициллинов/или их комбинации (ампициллин, амоксициллин/клавуналовая кислота), аминогликозидов (стрептомицин, гентамицин), фторхинолонов (норфлоксацин, ципрофлоксацин, левофлоксацин), тетрациклинов (доксициклин), карбопенемов (имепенем) и цефалоспорины 3 поколения (цефтриаксон, цефиксим, цефтазидим). Всего 12 перпаратов.

В качестве изучаемых факторов выбрали: факторы растительного происхо^дения (корки граната, черемухи плоды, соплодия ольхи, трава тысячелистника обыкновенного, корень горца змеиного) [9].

Оценку влияния изучаемых факторов на чувствительность к антимикробным препаратам проводили путем соинкубирования взвеси культуры, выращенной на мясопептонном бульоне с изучаемым фактором в условиях шейкер-инкубатора при 370С – 60 минут. Затем смесь центрифугировали при 3000 оборотах в минуту, после чего культуру двукратно отмывали физиологическим раствором и пересевали на скошенный 3,6 % мясопептонный агар. Отсеянные культуры после воздействия фактора инкубировали при температуре 370 С в течение 16–18 ч. с последующим определением у изолятов чувствительности к антимикробным препаратам. Контролем слу^или значения результатов чувствительности к антибиотикам у этих ^е штаммов культур полученные без влияния испытуемых факторов [10].

Статистическую обработку результатов исследований проводили, используя возмо^ности программы Microsoft Excel 2010.

Результаты и обсуждения. Бактерии E. coli выделенные от телят с признаками острых кишечных инфекций проявляли чувствительность и резистентность к антимикробным препаратам в разной степени (таблица 1).

В отношении антибиотиков пенициллинового ряда E. coli проявляли практически полную устойчивость, в частности: к ампициллину - в 100% случаев, к амоксициллину в комбинации с клавуналовой кислотой в 80% случаев.

Препараты группы аминогликозидов были эффективнее в отношении E.coli, к ним высокую чувствительность проявляли до 60% культур. Сравнивая среднестатистические показатели видно, что культуры E.coli проявляют высокую чувствительность к гентамицину и проме^уточную к стрептомицину.

Разная чувствительность наблюдалась у E.coli к препаратам фторхинолонового ряда. К ципрофлоксацину в среднем были резистентны 60% культур E. coli . К левофлоксацину проявляли чувствительность 40 % культур E.coli, проме^уточная чувствительность наблюдалась у 20% и резистентность у 40%. Норфлоксацин полностью подавлял рост у 40% культур, умеренно - у 20% и согласно средним показателям культуры E.coli имели проме^уточную чувствительность к препарату.

В отношении доксициклина согласно средним показателям культуры E.coli имели проме^уточную чувствительность, а в частности 60% культур были чувствительны, а 40% - резистентны.

Хорошо показал себя имепенем – антимикробный препарат из группы карбопенемов. В 100% случаев культуры E.coli были чувствительны к этому антибиотику. Среднестатистические результаты интерпретируются аналогично.

Цефалоспорины показали себя неоднозначно. К цефиксиму были полностью резистентны более 60% культур E.coli. Среднестатистические данные показали, что исследуемые культуры проявляют устойчивость к цефиксиму. По отношению к цефтазидиму 20% культур обладали чувствительностью, 40% -проме^уточной чувствительностью и 40% - были резистентны. Согласно среднестатистическим показателям культуры E. coli по отношению к цефтазидиму имели проме^уточную чувствительность, в отношении цефтриаксона - умеренную чувствительность, По факту около 40% культур были абсолютно резистентны, остальные проявляли либо полную, либо умеренную чувствительность.

В целом, считаем, что для анализа картины чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам мо^но руководствоваться среднестатистическими данными, для того чтобы впоследствии мо^но было проследить изменения чувствительности микроорганизмов к этим ^е препаратам после действия изучаемых факторов.

Представляется следующая картина относительно чувствительности к антимикробным препаратам у E. coli. До воздействия факторов растительного происхо^дения бактерии были чувствительны к гентамицину, левофлоксацину и имепенему, имели проме^уточную чувствительность к стрептомицину, цефтазидиму, доксициклину, норфлоксацину, цефтриаксону и абсолютная резистентность была выявлена к четырем из двенадцати препаратов - к цефиксиму, ципрофлоксацину, амоксициллину в комбинации с клавуналовой кислотой, и ампициллину.

^нализируя данные таблицы 1 после воздействия факторов на культуры E. coli отмечаем, что отвар плодов черемухи усилил антибиотикочувствительность Escherichia к 10 из 12 препаратов.

Таблица 1 - Среднестатистические данные зон подавления роста у E. coli до и после влияния факторов растительного происхо^дения, мм (M ± m).

Наименование антимикробного препарата	Контроль	Фактор
		отвар плодов черемухи	отвар гранатовых корок	настой соплодий ольхи	настой травы тысячелистника	настой корня горца змеиного
^мпициллин	7,0±0,31	7,0±0,31	7,0±0,31	6,8±0,20	8,0±1,26	7,2±0,20
^моксициллин / клавуналовая кислота	11,8±2,01	12,6±3,02	12,0±1,81	11,8±1,28	10,2±1,82	11,0±2,09
Стрептомицин	12,8±2,37 п	13,6±2,13 п	17,2±2,55 ч	16,2±1,46 ч	10,2±1,52	11,8±2,39
Гентамицин	15,6±2,54 ч	16,0±1,81 ч	17,8±1,93 ч	19,6±3,53 ч	19,0±0,63 ч	19,2±0,80 ч
Ципрофлоксацин	14,6±3,75	18,2±3,67 п	18,8±2,43 п	20,4±2,48 п	21,8±3,08 ч	20,2±2,70 п
Левофлоксацин	17,8±3,83 ч	17,8±2,47 ч	21,0±2,25 ч	13,8±0,91	20,2±4,40 ч	21,0±2,09 ч
Норфлоксацин	15,0±3,24 п	15,2±2,47 п	20,2±2,95 ч	18,8±1,82 ч	17,4±1,60 ч	18,4±0,60 ч
Доксициклин	13,8±2,85 п	18,2±2,74 ч	22,2±2,13* ч	7,6±0,60	9,0±1,04	7,0±0,00
Имепенем	24,0±1,14 ч	26,8±0,86 ч	28,2±1,77 ч	27,2±1,24 ч	26,2±1,88 ч	27,2±1,39 ч
Цефтриаксон	15,6±4,09 п	21,4±2,56 ч	22,8±2,41 ч	22,0±1,92 ч	21,0±3,00 ч	22,2±2,47 ч
Цефиксим	13,4±2,66	16,2±3,43 п	19,2±1,96 ч	20,6±1,69 ч	17,0±3,14 п	18,6±3,59 п
Цефтазидим	15,2±2,33 п	17,0±1,87 п	22,2±1,93 ч	21,0±2,42 ч	19,8±1,39 ч	18,8±2,57 ч

Примечание: ч – чувствительные, п – проме^уточная чувствительность; * Р ≤0,05

Значения чувствительности к ампициллину (выра^еная резистентность) и левофлоксацину (выра^еная чувствительность) остались пре^ними. Чувствительность к амоксициллину в сочетании с клавуналовой кислотой незначительно повысилась (в 1,06 раза), при этом культуры остались резистентными к препарату.

Разряд чувствительности остался пре^ний к стрептомицину, норфлоксацину, цефтазидиму. E. coli были умеренно чувствительны к препаратам, их чувствительность повысилась незначительно – в 1,01-1,12 раза.

К гентамицину и имепенему культуры рода Escherichia были изначально чувствительны. В результате влияния на них отвара плодов черемухи чувствительность повысилась соответственно в 1,02 и 1,12 раза.

Нечувствительные к ципрофлоксацину и цефиксиму E.coli перешли в категорию умеренно чувствительных, а культуры, имевшие проме^уточную чувствительность к доксициклину и цефтриаксону стали чувствительны к этим препаратам, при этом диаметры зон подавления роста у культур увеличились соответственно в 1,21-1,24 и 1,32-1,37 раза.

Похо^ие изменения наблюдали и после действия других факторов.

При воздействии отвара гранатовых корок у культур E. coli чувствительность возросла к 11 препаратам.

К ампициллину чувствительность осталась пре^ней, к амоксициллину в сочетании с клавуналовой кислотой - возросла незначительно, но итоге культуры были резистентны к этим препаратам.

У нечувствительных к ципрофлоксацину и цефиксиму культур Escherichia чувствительность возросла в 1,28 и 1,43 раза, в результате они перешли в разряд проме^уточно-чувствительные и чувствительные.

У культур имевших проме^уточную чувствительность к стрептомицину, норфлоксацину, доксициклину (22,2±2,13* Р ≤0,05), цефтриаксону и цефтазидиму диаметры зон подавления роста увеличились в 1,34-1,61 раза и они стали чувствительными к действию препаратов. У культур изначально чувствительных к гентамицину, левофлоксацину и имепенему так^е чувствительность возросла в 1,10 раза.

При воздействии на культуры E. coli настоя соплодий ольхи уменьшились зоны задер^ки роста в отношении ампициллина, левофлоксацина, и доксициклина. К амоксициллину в сочетании с клавуналовой кислотой чувствительность осталась пре^ней. К названным препаратам Escherichia проявляли резистентность. К остальным препаратам после воздействия фактора чувствительность повысилась. Максимально к доксициклину в 1,80 раза и минимально к имепенему в 1,13 раза. Культуры, ранее проявлявшие резистентность и проме^уточную чувствительность стали чувствительными к действию антимикробных препаратов.

После воздействия настоя травы тысячелистника чувствительность в отношении амоксициллина в сочетании с клавуналовой кислотой, стрептомицина и доксициклина результаты чувствительности были пре^ние или понизилась. Культуры E. coli проявляли резистентность к этим препаратам.

Действие остальных антимикробных препаратов после действия настоя травы тысячелистника на культуры усиливалось, зоны подавления роста у культур увеличились в 1,13-1,53 раза.

После влияние настоя корня горца змеиного культуры были резистентны к ампициллину, амоксициллину в сочетании с клавуналовой кислотой, стрептомицину и доксициклину. По отношению к другим антимикробным препаратам чувствительность усилилась в 1,08-1,42 раза. Культуры были чувствительны к гентамицину, левофлоксацину, норфлоксацину, имепенему, цефтриаксону и цефтазидиму, и имели проме^уточную чувствительность к цефиксиму и ципрофлоксацину.

Таким образом, результаты исследований показали, что все пять изучаемых факторов растительного происхо^дения повышали чувствительность культур Escherichia coli к гентамицину, ципрофлоксацину, норфлоксацину, левофлоксацину, имепенему, цевтриаксону, цефиксиму и цефтазидиму, не всегда к стрептомицину, и доксициклину и практически не влияли (или незначительно) на чувствительность к ампициллину и амоксициллину в сочетании с клавуналовой кислотой. Способность изучаемых факторов повышать          антибиотикочувствительность          подтвер^дается среднестатистическими данными зон подавления роста у энтеробактерий рода Escherichia до и после влияния факторов.

Заключение. Полученные результаты открывают перспективу практического применения плодов черемухи, корок граната, соплодий ольхи, травы тысячелистника и корня горца змеиного по преодолению антибиотикорезистентности у Escherichia coli и для проведения дальнейших исследований в данном направлении.

Экспериментальные данные по изучению влияния факторов растительного происхо^дения на чувствительность к антимикробным препаратам in vitro показывают возмо^ность их применения in vivo для профилактики и лечения острых ^елудочно-кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных ^ивотных вызываемых патогенными и условнопатогенными Escherichia coli.