Перспективы использования хелатной формы цинка с гиалуронаном в качестве сеноморфика, модифицирующего анаболические функции сенесцентных хондроцитов

С возрастом во всех тканях и органах человека накапливается особый тип стареющих клеток – сенесцентные, которые представляют собой живые, метаболически активные, но неспособные к делению дифференцированные клетки. Любая клетка организма может стать сенесцентной в силу повреждений, вызванных как внутренними, так и внешними факторами. С точки зрения воздействия на окружающие ткани наиболее важным свойством стареющих клеток является приобретение ими особого секреторного фенотипа, ассоциированного со старением (англ. Senescence-Associated Secretory Phenotype, SASP). Общий провоспалительный фон, создаваемый стареющими клетками благодаря SASP, является одним из основных механизмов хронического стерильного воспаления, связанного со старением (inflammaging). SASP-фенотип характеризуется повышенной секрецией биологически активных молекул стареющими клетками, включая хе-мокины, цитокины, протеазы и факторы роста. По этим причинам SASP вовлечен в патогенез и прогрессирование заболеваний, связанных со старением, включая суставные патологии и, в частности, остеоартрит (ОА) [1, 2]. Ферменты, связанные с прогрессированием ОА, были идентифицированы как факторы SASP, и их избирательное модифицирование с помощью сеноморфиков (препараты, которые модулируют свойства стареющих клеток, подавляя фенотипы старения), может в перспективе применяться при ОА [3, 4]. Однако доказательства специфического и протекторного действия сеноморфиков при лечении ОА в настоящее время не найдены [5].

Выявление специфических биомаркеров для профилактики, лечения или идентификации стадий заболевания ОА стало актуальной проблемой клинической практики. Вариабильные эпитопы коллагена II типа, а также продукты деградации коллагена, в целом, такие как мочевой С-концевой телопептид коллагена II типа (uCTX-II), сывороточный олигомерный матриксный белок хряща (COMP) и протеогликаны – аггрекан, декорин, а также трансформирующий фактор роста (TGF-β) – являются основными хрящевыми биомаркерами [6]. Эти факторы продемонстрировали потенциальную применимость для оценки предрасположенности и тяжести текущего ОА. Однако, учитывая гетерогенность этого заболевания, отсутствие данных по их клинической валидации, отсутствие воспроизводимых и международно-признанных методов, ни один из вышеуказанных биомаркеров до сих пор не нашел рутинного применения в практике лечения ОА [7].

Протеогликаны: аггрекан, бигликан, декорин, перлекан и версикан вносят значительный вклад, как в поддержание здоровья суставного хряща, так и в процесс его восстановления [8]. Некоторые из них оказались полезными для определения временной стадии ОА в качестве биомаркеров [6]. Ингибирование экспрессии генов основных белковых комплексов – аггрекана и декорина способствует разрушению хряща суставов. Интересно, что при посттравматическом ОА декорин задерживает потерю фрагментированного аггре-кана и фибрилляцию поверхности хряща и, таким образом, играет защитную роль, замедляя дегенерацию хрящевой ткани [9]. В клеточной линии хондроцитов человека C28/I2 было определено влияние снижения экспрессии декорина на профили экспрессии генов и идентифицировано 1780 дифференциально экспрессируемых генов [10]. Исследование подтвердило, что снижение экспрессии основного гена декорина значительно подавляет пролиферацию и адгезию клеток, а также индуцирует апоптоз хондроцитов.

Кроме протеогликанов, значительную роль в артрологии при заболеваниях суставов играет трансформирующий фактор роста бета (TGF-β), который контролирует пролиферацию, клеточную дифференцировку и другие функции в большинстве клеток. Исследования показали, что TGF-β1 — ключевой ростовой фактор, необходимый для более эффективной дифференцировки МСК в хондроциты [10].

Цель исследования

Изучить как протез синовиальной жидкости с хелатной формой цинка и гиалуроновой кислотой влияет на экспрессию аггрекана, декорина и трансформирующего фактора роста TGF-β1 в культуре сенесцентных хондроцитов.

Материалы и методыДизайн исследования

Методами иммуноцитохимии изучали модулирующее действие хелатной формы цинка, как основного компонента в составе препарата «Ювента» – протеза синовиальной жидкости, на экспрессию TGF-β1, аггрекана и декорина в культуре хондроцитов при моделировании инфламэйд-жинга генотоксического стресса.

Протез синовиальной жидкости «Ювента» [11, 12] (состав: натриевая соль гиалуроновой кислоты – 15 мг/мл, натрия хлорид 8,5 мг/мл, натрия гидрофосфат дигидрат 3,5 мг/мл, натрия дигидрофосфат дигидрат 0,4 мг/мл; хлористый цинк 0,025 мг/мл) готовили для экспериментов по следующей схеме: 2,0 мл геля разводили физраствором до 10 мл и по 1 мл вводили в ростовую среду.

В проведенном исследовании источником первичной культуры хондроцитов являлась биопсия реберной хрящевой ткани, которая культивировалась в виде монослоя и поддерживалась в условиях in vitro в культуральной среде по стандартным протоколам. Для моделирования инфла-мэйджинга генотоксического стресса на культуру клеток воздействовали бактерицидной дезинфицирующей лампой Philips TUV 8W (Philips, Нидерланды), производящей коротковолновое ультрафиолетовое излучение с пиковым значением на длине волны 253,7 нм.

В исследовании использовали четыре типа культур: контрольная – нормальная культура хондроцитов (2–4 пассаж с добавлением ростовой среды), инкубация 24 часа; культура с моделью инфламэйджинга (МИ) – культура с моделированным естественным клеточным старением хондроцитов в физрастворе, инкубация 24 часа; культура с комбинацией инфламэйджинг + гиалуроновый гель (МИ+ГК) (аналогичный по составу с «Ювентой», но без цинка); культура с комбинацией инфламэйджинг + «Ювента» (МИ+ЮВЕНТА).

Для верификации наличия белковых факторов в клетках был применён метод иммуноцитохимии с использованием первичных моноклональных антител коллагена II, IV типов. Для последующей визуализации методом иммунофлуорес-центной конфокальной микроскопии были использованы вторичные антитела, конъюгированные с Alexa Fluor 488 и Alexa Fluor 647 (1:1000, Abcam). Окрашивание препаратов проводили по стандартному протоколу. Разницу в экспрессии исследуемого маркера TGF-β1, аггрекана и декорина в каждой из четырёх культур наблюдали в зависимости от интенсивности свечения красителей (рис. 1–3).

Контроль (Alexa 488)                   МИ (Alexa 488)

МИ + ГК (Alexa 488)             МИ + «Ювента» (Alexa 488)

Рисунок 1. Экспрессия TGF-β1 в культуре хондроцитов в контрольной группе и при развитии инфламэйджинга. Увеличение: х1000

Рисунок 2. Экспрессия аггрекана в культуре хондроцитов в контрольной группе и при развитии инфламэйджинга. Увеличение: х1000

Контроль (Alexa 488)                  МИ (Alexa 488)

МИ + ГК (Alexa 488)            МИ + «Ювента» (Alexa 555)

Рисунок 3. Экспрессия декорина в культуре хондроцитов в контрольной группе и при развитии инфламэйджинга. Увеличение: х1000

Статитстический анализ

Результаты исследования оценивали морфометрическим методом с помощью инвертированного микроскопа Olympus IX73 (Olympus, Япония) и программного обе-

спечения cellsens Standart. Относительную площадь экспрессии рассчитывали, как площадь экспрессии маркера к общей площади поля зрения. Статистическую обработку проводили в программе Origin. Для сравнения групп использовали непараметрический U-критерий Манна Уитни. Различия считали статистически значимыми при р≤0,05. Результаты представлены в виде среднего и стандартной ошибки среднего.

Результаты исследования

На рисунках 4–6 представлены экспериментальные данные по уровню экспрессии генов, кодирующих белки TGF-β1, аггрекан и декорин в культуре хондроцитов, подвергнутых УФ-излучению, что приводит к формированию сенесцентного клеточного фенотипа, ассоциированного со старением (SASP-фенотипа).

Площадь экспрессии TGF-β1 в культуре хондроцитов в контрольной группе составляла 0,51 %. При развитии у клеток SASP-фенотипа, экспрессия TGF-β1 в группе МИ снизилась до уровня 0,12 %, что соответствовало уменьшению в 4,25 раза. Введение ГК и препарата «ЮВЕНТА» привело к практически равному уровню экспрессии TGF- β1: 1,47 % и 1,45 %, соответственно, что соответствовало 12-ти кратному росту по сравнению с культурой сенесцентных хондроцитов при моделировании естественного клеточного старения. Влияние хелатной формы цинка в этой серии экспериментов выявлено не было.

Экспрессия аггрекана в культуре хондроцитов в контрольной группе составляла 3,37 %. В группе моделирования инфламэйджинга при воздействии УФ-излучения и развития у клеток SASP-фенотипа, экспрессия аггрека-на снизилась в 5,6 раза и составила 0,60 %. Введение ГК привело к увеличению уровня экспрессии аггрекана до 1,34 %, а препарат «ЮВЕНТА» достоверно повысил уровень его экспрессии до 5,88 %, что почти в 10 раз выше по сравнению с культурой сенесцентных хондроцитов в моделировании естественного клеточного старения. Наблюдаемый эффект препарата, содержащего ГК с хелатом цинка – особенно значимый результат нашей работы, т.к. аггрекан – основной протеогликан хрящевого межклеточного матрикса, от которого, в основном, зависит гомеостаз суставного хряща.

Что касается декорина, то перевод нормальных хондроцитов в сенесцентное состояние сопровождался самым значительным снижением экспрессии гена, кодирующего декорин: более, чем в 16 раз снизился его уровень (рис. 6) в клеточной культуре при УФ-облучении (площадь экспрессии декорина в культуре хондроцитов в контрольной группе составляла 0,98 %, а в группе моделирования инфламэйджинга – 0,06 %). Значительного влияния хелата цинка в составе препарате «ЮВЕНТА» по сравнению с чистым ГК зафиксировано не было: площадь экспрессии составила 1,59 % для ГК и 1,75 % для препарата «ЮВЕНТА», что статистически не значимо.

Рисунок 6. Уровень экспрессии декорина в исследуемых группах клеточных культур, подвергнутых генотоксическому стрессу в модели инфламэйджинга генотоксического стресса. Примечание: * - статистически значимое различие между группами клеток, p <0,05. Исследуемые группы: контрольная – нормальная культура хондроцитов (2–4 пассаж с добавлением ростовой среды), инкубация 24 часа; культура с моделью инфламэйджинга (МИ) – культура с моделированным естественным клеточным старением хондроцитов в физрастворе, инкубация 24 часа; культура с комбинацией инфламэйджинг + гиалуроновый гель (МИ+ГК) (аналогичный по составу с «Ювентой», но без цинка); культура с комбинацией инфламэйджинг + «Ювента» (МИ+ЮВЕНТА.)

Рисунок 4. Уровень экспрессии транформирующего фактора роста TGF-β1 в исследуемых группах клеточных культур, подвергнутых генотоксическому стрессу в модели инфламэйджинга генотоксического стресса.

Примечание: * - статистически значимое различие между группами клеток, p <0,05. Исследуемые группы: контрольная – нормальная культура хондроцитов (2-4 пассаж с добавлением ростовой среды), инкубация 24 часа; культура с моделью инфламэйджинга (МИ) – культура с моделированным естественным клеточным старением хондроцитов в физрастворе, инкубация 24 часа; культура с комбинацией инфламэйджинг + гиалуроновый гель (МИ+ГК) (аналогичный по составу с «Ювентой», но без цинка);

культура с комбинацией инфламэйджинг + «Ювента» (МИ+ЮВЕНТА.)

Рисунок 5. Уровень экспрессии Аггрекана в исследуемых группах клеточных культур, подвергнутых генотоксическому стрессу в модели инфламэйджинга генотоксического стресса. Примечание: * - статистически значимое различие между группами клеток, p <0,05. Исследуемые группы: контрольная – нормальная культура хондроцитов (2–4 пассаж с добавлением ростовой среды), инкубация 24 часа; культура с моделью инфламэйджинга (МИ) – культура с моделированным естественным клеточным старением хондроцитов в физрастворе, инкубация 24 часа; культура с комбинацией инфламэйджинг + гиалуроновый гель (МИ+ГК) (аналогичный по составу с «Ювентой», но без цинка); культура с комбинацией инфламэйджинг + «Ювента» (МИ+ЮВЕНТА.)

Обсуждение

В нашем исследовании рассмотрено влияние препарата «Ювента» на ключевые компоненты гомеостаза хрящевой ткани в условиях индуцированного клеточного старения. Полученные результаты свидетельствуют о том, что интеграция хелатной формы цинка в структуру гиалуроновой кислоты не просто потенцирует действие последней, но и качественно меняет биологический ответ сенесцентных хондроцитов. Обнаруженное нами десятикратное увеличение экспрессии аггрекана и существенная модуляция уровня TGF-β1 указывают на восстановление анаболической активности клеток, ранее находившихся в состоянии глубокого функционального угнетения под воздействием генотоксического стресса. Это позволяет рассматривать исследуемую комбинацию как эффективный инструмент преодоления "инфламэйд-жинга" в суставном хряще. Изучение роли TGF-β1 в патогенезе ОА показывает, что TGF-β1 способствует заживлению тканей, уравновешивает действие матриксных металлопротеиназ, которые стимулируются воспалительными цитокинами и продуктами деградации хрящевого внеклеточного матрикса. Сигнальный путь TGF-β регулирует экспрессию факторов транскрипции и факторов роста, контролируя пролиферацию и дифференцировку хондроцитов [13, 14]. Транскрипционный фактор FOXO1 является ключевым регулятором аутофагии. В хондроцитах снижение экспрессии FOXO1 с возрастом вызывает ОА из-за дисфункции аутофагии. В исследовании авторов Kurakazu I et al. [13] изучался механизм, посредством которого сигнализация трансформирующего фактора роста TGFβ1 регулирует ось FOXO1-аутофагия. Фактор TGFβ1 способствовал экспрессии мРНК и белка FOXO1, который снижается с возрастом. TGFβ1 защищает хондроциты от окислительного стресса через ось FOXO1-аутофагия [13]. В научной литературе встречается мнение, что фактор TGFβ1 может провоцировать артрофиброз. Артрофиброз или чрезмерное рубцевание суставов — это изнурительное состояние, вызывающее боль и скованность вследствие прогрессирования ОА. В основе патологии лежит нарушение регуляции сигнального пути трансформирующего фактора TGF-β1, что стимулирует фиброгенез. Однако данные, полученные при исследовании других органов и систем, свидетельствуют о том, что интерлейкин-11 (IL-11) опосредует фиброз в результате действия TGF-β1. В современном исследовании 2025 года изучали взаимосвязь между IL-11 и синовиальным фиброзом у пациентов с терминальной стадией ОА коленного сустава. Результаты демонстрируют сильную взаимосвязь между IL-11 и состоянием синовиального фиброза у пациентов с запущенным OA, указывая на то, что IL-11, а не TGF-β1, является ключевым медиатором этого процесса [15]. Результаты, полученные в нашей работе, демонстрируют, что сочетанное применение гиалуроновой кислоты с хелатной формой цинка позволяет преодолеть метаболическую инертность се-несцентных хондроцитов, инициируя мощный анаболический ответ в виде многократного усиления экспрессии аггрекана и восстановления регуляторного потенциала через модуляцию фактора TGF-β1.

Разрушение суставного хряща при ОА начинается с истощения сети гиалуронан-аггрекан с последующей деградацией коллагеновых фибрилл. Снижение способности удерживать протеогликан аггрекан является ранним проявлением ОА. Повышенный оборот гиалуронана тесно связан с изменениями уровня аггрекана [16]. Без правильно закрепленного на клеточной поверхности аг-грекана несущая функция хряща оказывается под угрозой. Закрепление происходит только за счёт связывания аггрекана с гиалуроновой кислотой, когда гиалуронан координируется либо с гиалуронансинтазой HAS2, либо за счет мультивалентного связывания с клеточным рецептором гиалуронана - CD44 [17]. Полученные нами данные по увеличению экспрессии аггрекана под действием препарата «Ювента» наглядно демонстрируют синергетический эффект гиалуронана и хелатной формы цинка, который позволяет не только компенсировать дефицит основного протеогликана в стареющих хондроцитах, но и значимо превосходить результаты применения традиционных монопрепаратов гиалуроновой кислоты.

Белок декорин, как один из типов молекул внеклеточного матрикса, является прототипом семейства малых лейцин-богатых протеогликанов. Имея молекулярную массу около 100 кДа, он состоит из 40-кДа основного белка и одной боковой цепи хондроитинсульфата или дерматансульфата. Малоразмерные протеогликаны, к которым и относится декорин, являются хорошо известными стимуляторами фибриллогенеза коллагена в соединительных тканях. Результаты исследований показали, что каждый такой протеогликан уникальным образом влияет на структуру коллагена как на уровне фибрилл, так и на уровне зрелых волокон, изменяя механическую реакцию тканей на нагрузку [18]. В частности, декорин продемонстрировал значительные различия в свойствах растяжения по сравнению с бигликаном и фибромоду-лином, что подчеркивает его особую роль в обеспечении структурно и механически прочного ответа при растягивающей нагрузке. Действие декорина разнообразно и включает способность функционировать как эндогенный панрецепторный ингибитор тирозинкиназы, регулятор как аутофагии, так и митофагии, а также как модулятор иммунной системы. Декорин проявил себя как мощный антифибротический агент [19]. Результаты нашего исследования демонстрируют, что несмотря на выраженное снижение экспрессии декорина при формировании сенесцентного фенотипа хондроцитов, добавление гиалуроновой кислоты, как в чистом виде, так и в составе протеза синовиальной жидкости с хелатной формой цинка, приводит к частичному восстановлению его экспрессии, однако не сопровождается цинк-зависимым усилением данного эффекта.

Заключение

Результаты нашей работы вносят заметный вклад в понимании молекулярно-клеточного механизма инициирования и прогрессирования суставных патологий и возможность влиять на важнейшие регуляторы клеточного метаболизма, необходимые для поддержания хрящевого гомеостаза. Показано, что генотоксический стресс сопровождается выраженным снижением экспрессии аггрекана, декорина и трансформирующего фактора роста TGF-β1, что отражает угнетение анаболической активности клеток и нарушение структуры внеклеточного матрикса, характерные для остеоартрита. Добавление гиалуроновой кислоты частично восстанавливало экспрессию исследуемых маркеров, тогда как применение препарата «Ювен-та», способного реанимировать анаболический потенциал сенесцентных хондроцитов. Это приводило к селективному и статистически значимому увеличению экспрессии аггрекана — основного протеогликана хрящевого матрикса. При этом влияние хелатной формы цинка не сопровождалось дополнительным усилением экспрессии декорина и TGF-β1, что указывает на избирательный характер действия препарата на анаболический профиль сенесцентных хондроцитов.

Практическая значимость работы заключается в экспериментальном обосновании перспективности применения гиалуронанового гидрогеля с хелатной формой цинка как средства, способного избирательно усиливать синтез аггрекана в условиях клеточного старения, что открывает новые подходы к поддержанию хрящевого гомеостаза при остеоартрите.

Результаты настоящего исследования продолжают цикл работ, проводимых в АНО «Научно-исследовательский центр гиалуроновой кислоты», которые на примере биомаркеров: лубрицина, коллагена II и IV, SOX9, RUNX2, NF-kB, СD44 позволили выявить у препарата «ЮВЕН-ТА» выраженные общерегуляторные и геропротекторные свойства.