Перспективы использования методов молекулярно-генетического анализа в почвенной экологии
Автор: Петрова С.Н., Андронов Е.Е., Пинаев А.Г., Першина Е.В.
Журнал: Вестник аграрной науки @vestnikogau
Рубрика: Научное обеспечение развития растениеводства
Статья в выпуске: 5 (26), 2010 года.
Бесплатный доступ
Показаны возможности современных молекулярных методов в экологии микроорганизмов почвы. Демонстрируется анализ динамики почвенных микроорганизмов во всех основных группах (грибы, археи, бактерии) с использованием ПЦР с детекцией в реальном времени и анализ видовой структуры с помощью метода T-RFLP.
Микробное сообщество почвы, пцр с детекцией в реальном времени
Короткий адрес: https://sciup.org/147123562
IDR: 147123562
Текст научной статьи Перспективы использования методов молекулярно-генетического анализа в почвенной экологии
клетками) применять методы, дающие однозначные результаты. В связи с этим значительно возросла доказательная база биологических исследований, проводимых с использованием новой методологии. Следствием широкого проникновения молекулярной биологии практически во все сферы биологической науки явилось появление новых пищевых продуктов, диагностических препаратов, реагентов, новых сортов растений, пород животных и т.д. Объем знаний, полученных за последние десятилетия, сопоставим с объемом, накопленным в области биологии за несколько веков ее существования . Только в международной базе генетических данных GenBank число нуклеотидных последовательностей ежегодно удваивается и на сегодняшний день превышает 70 миллионов [1, 2].
Ныне любое исследование , претендующее на концептуальность и значимость , по возможности должно включать молекулярно - генетическое подкрепление .
Несомненные перспективы практического применения молекулярно - генетические методы имеют в почвенной экологии с целью изучения и профилирования микробного почвенного сообщества . Идея заключается в том , что структура микробного сообщества почв является тонким и чувствительным индикатором ее экологического благополучия и плодородия .
Особенностью микробного сообщества почвы является его крайне высокая численность , составляющая до нескольких миллиардов микроорганизмов в одном грамме почвы и исключительное генетическое разнообразие , достигающее , как минимум , нескольких тысяч таксономических групп . Особенно важно отметить , что большинство из этих микроорганизмов являются некультивируемыми , и , как следствие , мало известными науке . Микробное сообщество почвы , его генетическая структура , очень точно и быстро отзывается на всякий внешний фактор , будь то температура , влажность , избыток или недостаток питательных субстратов , засоление или изменение pH. Однако данный процесс изучен мало , особенно в свете последних достижений молекулярной экологии микроорганизмов , демонстрирующих гораздо более высокое разнообразие микробиоты почвы , чем предполагалось ранее [3, 4, 5].
Именно для восполнения данного пробела , а также для поиска эффективных средств мониторинга экологического состояния почв в течение трех лет нами были реализованы проекты ( поддержанные РФФИ ), связанные с исследованием изменений почвенного биоразнообразия в ответ на воздействие биотических и абиотических факторов .
Использование современных методов молекулярно - генетических анализов , не связанных с культивированием микроорганизмов на питательных средах , позволило изучить все эколого - трофические группы микроорганизмов почвенного сообщества , включая бактерии , археи и грибы .
Материалы и методика исследований
ДНК выделяли из навески почвы 0.5 г , которую отбирали в пластиковую пробирку (2 мл ) с завинчивающейся крышкой . К каждой навеске добавляли 750 мкл буфера I (CTAB 2%; TRIS-HCl 0.1M; EDTA 20 м M; NaCl 1.4 M; pH=8.5) и 0.5 г стеклянных шариков (0.35 мм ). Пробы прогревали в течение 30 мин при 65° С . Разрушение пробы проводили в гомогенизаторе FastPrep 24 46
(M.P.Biomedicals) в течение 1 мин при максимальной интенсивности встряхивания (6.5 м / с ). Затем прогревание повторяли . Пробу дважды экстрагировали хлороформом , суммарную ДНК осаждали изопропанолом , растворяли в 100 мкл буфера TE (TRIS-HCl 10 м M; EDTA 1 м M) и смешивали со 100 мкл расплавленной 2% легкоплавкой агарозы (Sigma). После застывания агарозные блоки несколько раз отмывали в 2- х мл буфера TE (3 раза по 3 часа ). Далее агарозу расплавляли при 65° С , добавляли ацетат натрия до конечной концентрации 0.3 М , дважды экстрагировали фенолом , один раз фенол - хлороформом (1:1), один раз хлороформом , последний раз отбирали 350 мкл водной фазы . ДНК осаждали изопропанолом , промывали 70% этанолом , подсушивали и растворяли в 50 мкл воды . Выход ДНК был весьма значителен и составлял не менее 2 мкг ДНК на 1 г почвы .
Определение численности основных групп микроорганизмов проводили с использованием ПЦР с детекцией в реальном времени (Real-time). В качестве контроля для бактерий использовали клонированные фрагменты таксономически значимых генов : 16S рРНК Escherichia coli для количественного определения бактерий , 16S рРНК штамма FG-07 Halobacterium salinarum ( данные неопубликованы , Г . Ю ргенс , Университет Хельсинки ) для количественного определения архей , ITS штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae Meyen 1B-D1606 для количественного определения грибов . Были использованы следующие праймеры : Eub338/Eub518 – для бактерий [6], arc915f/arc1059r – для архей [7], ITS1f/5.8s – для грибов [6]. Указанные праймеры использовали для количественного определения штамма ГММ со следующим температурным профилем : 94° С – 10 с ; 63° С – 10 с ; 72° С – 30 с ; детекцию флюоресценции проводили при 72° С . Во всех случаях использовали Taq- полимеразу ( Хеликон ) – 2 ед . на реакцию , в реакционную смесь добавляли SYBR-green (Amresco) до конечной концентрации 0.3× и флюоресцеина изотиоцианат ( конечная концентрация 10 нм ). ПЦР с детекцией в реальном времени проводили в амплификаторе iCycler (BioRad) в трех повторностях . Для обработки результатов количественной ПЦР использовали программное обеспечение , прилагающееся к прибору iCycler. Количественные характеристики выражали в числе копий РНК - оперонов .
Анализ таксономической структуры микробных сообществ осуществлялся с помощью метода T-RFLP (terminal Restriction Fragments Length Polymorphysm) Для T-RFLP использовали следующие праймеры : 63f/1494r – для бактерий [8], Ar3f/Ar927r – для архей [9], ITS1/ITS4 [10], причем праймеры 63f, Ar3f, ITS1 были флюоресцентно мечены ( флюорофор D4, инфракрасный , для системы CEQ8000 Beckman Coulter, Sigma). ПЦР проводили с использованием Taq- полимеразы ( Хеликон ) со стандартным буфером с добавлением BSA до конечной концентрации 100 мкг / мл , в соответствии с указаниями упомянутых выше авторов . Тотальную почвенную ДНК разводили в 10 раз и использовали для ПЦР в количестве 1 мкл
1.00 Е +10
грибы археи бактерии
1.00 Е +09
1.00 Е +08
1.00 Е +07
1.00 Е +06
1.00 Е +05
Сутки
уже заняты , а само сообщество находится в состоянии равновесия [12, 13, 14].
Заключение
Результаты наших исследований демонстрируют реальный потенциал современных молекулярных методов в экологии микроорганизмов . Их преимущество по сравнению с классическими бесспорно . Существующие на сегодняшний день методы молекулярно - генетического анализа позволяют в полной мере оценить структурно функциональные особенности микробного сообщества окружающей среды : идентификация таксономических групп различного уровня , определение структуры ( видового состава ) микробиологических сообществ , мониторинг штаммов ( генов ) в окружающей среде .
Молекулярная биология создает базу для развития новых технологий , влияние которых распространяется практически во все науки и всё глубже проникает в наш быт .
Работы осуществлялись при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований в рамках выполнения гранта РФФИ № 09-04-90815 и № 09-04-00386.
Теоретический и научно - практический журнал . Основан в 2005 году
Адрес редакции: 302019, г. Орел, ул. Генерала Родина, 69.
Сдано в набор 14.10.2010
Подписано в печать 28.10.2010 Формат 60х84/8. Бумага офсетная.
Гарнитура Таймс.
Объём 12,5 усл. печ. л. Тираж 300 экз. Издательство Орел ГАУ, 302028, г. Орел, бульвар Победы, 19.
Лицензия ЛР№021325 от 23.02.1999 г.
Ж урнал рекомендован ВАК Минобрнауки России для публикаций научных работ, отражающих основное научное содержание кандидатских и докторских диссертаций
Содерж ание номера
Список литературы Перспективы использования методов молекулярно-генетического анализа в почвенной экологии
- Ярилин, А.А. Золушка становится принцессой, или место биологии в иерархии наук [Текст]/А.А. Ярилин//Эколония и жизнь. -2008. -№12. -с. 10
- Лукашов, В.В. Молекулярная эволюция и филогенетический анализ [Текст]/В.В. Лукашов. -М.: БИНОМ. 209. -256 с
- Hoppener-Ogawa, S. Specific detection and real-time PCR quantification of potentially mycophagous bacteria belonging to the genus collimonas in different soil ecosystems [Теxt]/S. Hoppener-Ogawa, J.H.J. Leveau, W. Smant, J.A. van Veen, W. de Boer//Appl. Environ. Microbiol. -2007. -V. 73. -13. -P. 4191-4197
- Sung-Keun, R. Estimation of Distribution of a Commensal Thermophile in Soil by Competitive Quantitative PCR and Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis [Теxt]/R. Sung-Keun, S. Hong, J. Bae, C. Jeon, S. Lee, J. Song, H. Poo, M. Sung//J. Microbiol. Biotechnol. -2001. -Vol. 11. -No. 6. -P. 940-945
- Chen, A., Molecular detection and direct enumeration of methanogenic Archaea and methanotrophic Bacteria in domestic solid waste landfill soils [Теxt]/A. Chen, K. Ueda, Y. Sekiguchi, A. Ohashi, H. Harada//Biotechnol. Lett. -2004. -V. 25. 18. -P. 1563-1569
- Fierer, N. Assessment of soil microbial community structure by use of taxon-specific quantitative PCR assays [Теxt]/N. Fierer, J.A. Jackson, R. Vilgalys, R.B. Jackson//Appl. Environ. Microbiol. 2005. Vol. 71, No. P. 4117-4120
- Yu, Y. Group-specific primer and probe sets to detect methanogenic communities using quantitative real-time polymerase chain reaction [Теxt]/Y. Yu, Ch. Lee, J. Kim, S. Hwang//Biotechnol. Bioeng. -2005. -Vol. -89. No. -6., P -670-679
- Singh, B.K. Use of Multiplex Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism for Rapid and Simultaneous Analysis of Different Components of the Soil Microbial Community [Теxt]/B.K. Singh, L. Nazaries, S. Munro, I.C. Anderson, K.D. Campbell//Appl. Environ. Microbiol. -2006. -Vol. 72. -No. 11. -P. 7278-7285
- Sung-Keun, R. Estimation of Distribution of a Commensal Thermophile in Soil by Competitive Quantitative PCR and Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis. [Теxt]/R. Sung-Keun, S. Hong, J. Bae, C. Jeon, S. Lee, J. Song, H. Poo, M. Sung//J. Microbiol. Biotechnol. -2001. -Vol. 11. -No. 6. -P. 940-945
- Innis, M. A., and D. H. Gelfand. PCR protocols: a guide to methods and applications [Теxt] San Diego, Calif. -Academic Press. -1990
- Malferrari, G. High-quality genomic DNA from human whole blood and mononuclear cells [Теxt]/G. Malferrari, E. Monferini, P. DeBlasio, G. Diaferia, G. Saltini, E. Del Vecchio, L. Rossi-Bernardi, I. Biunno//BioTechniques. -2002. -Vol. 33. -No. 6. P. -1228-1230
- Amarger, N. Genetically modified bacteria in agriculture [Теxt]//Biochimie. 2002. V. 84. P. 1061-1072
- Hirsh, P.R. Release of transgenic bacterial inoculants -rhizobia as a case study//Plant and Soil. -2004. -V. -266.P. 1-10
- Андронов, Е.Е. Влияние внесения генетически модифицированного штамма Sinorhizobium meliloti ACH-5 на структуру почвенного сообщества микроорганизмов [Текст]/Е.Е. Андронов, С.Н. Петрова, Е.П.Чижевская, Е.В. Коростик, Г.А. Ахтемова, А.Г Пинаев.//Микробиология. -2009. -Т.78. -№4. -с. 1-10