Перспективы использования методов молекулярно-генетического анализа в почвенной экологии

клетками) применять методы, дающие однозначные результаты. В связи с этим значительно возросла доказательная база биологических исследований, проводимых с использованием новой методологии. Следствием широкого проникновения молекулярной биологии практически во все сферы биологической науки явилось появление новых пищевых продуктов, диагностических препаратов, реагентов, новых сортов растений, пород животных и т.д. Объем знаний, полученных за последние десятилетия, сопоставим с объемом, накопленным в области биологии за несколько веков ее существования . Только в международной базе генетических данных GenBank число нуклеотидных последовательностей ежегодно удваивается и на сегодняшний день превышает 70 миллионов [1, 2].

Ныне любое исследование , претендующее на концептуальность и значимость , по возможности должно включать молекулярно - генетическое подкрепление .

Несомненные перспективы практического применения молекулярно - генетические методы имеют в почвенной экологии с целью изучения и профилирования микробного почвенного сообщества . Идея заключается в том , что структура микробного сообщества почв является тонким и чувствительным индикатором ее экологического благополучия и плодородия .

Особенностью микробного сообщества почвы является его крайне высокая численность , составляющая до нескольких миллиардов микроорганизмов в одном грамме почвы и исключительное генетическое разнообразие , достигающее , как минимум , нескольких тысяч таксономических групп . Особенно важно отметить , что большинство из этих микроорганизмов являются некультивируемыми , и , как следствие , мало известными науке . Микробное сообщество почвы , его генетическая структура , очень точно и быстро отзывается на всякий внешний фактор , будь то температура , влажность , избыток или недостаток питательных субстратов , засоление или изменение pH. Однако данный процесс изучен мало , особенно в свете последних достижений молекулярной экологии микроорганизмов , демонстрирующих гораздо более высокое разнообразие микробиоты почвы , чем предполагалось ранее [3, 4, 5].

Именно для восполнения данного пробела , а также для поиска эффективных средств мониторинга экологического состояния почв в течение трех лет нами были реализованы проекты ( поддержанные РФФИ ), связанные с исследованием изменений почвенного биоразнообразия в ответ на воздействие биотических и абиотических факторов .

Использование современных методов молекулярно - генетических анализов , не связанных с культивированием микроорганизмов на питательных средах , позволило изучить все эколого - трофические группы микроорганизмов почвенного сообщества , включая бактерии , археи и грибы .

Материалы и методика исследований

ДНК выделяли из навески почвы 0.5 г , которую отбирали в пластиковую пробирку (2 мл ) с завинчивающейся крышкой . К каждой навеске добавляли 750 мкл буфера I (CTAB 2%; TRIS-HCl 0.1M; EDTA 20 м M; NaCl 1.4 M; pH=8.5) и 0.5 г стеклянных шариков (0.35 мм ). Пробы прогревали в течение 30 мин при 65^° С . Разрушение пробы проводили в гомогенизаторе FastPrep 24 46

(M.P.Biomedicals) в течение 1 мин при максимальной интенсивности встряхивания (6.5 м / с ). Затем прогревание повторяли . Пробу дважды экстрагировали хлороформом , суммарную ДНК осаждали изопропанолом , растворяли в 100 мкл буфера TE (TRIS-HCl 10 м M; EDTA 1 м M) и смешивали со 100 мкл расплавленной 2% легкоплавкой агарозы (Sigma). После застывания агарозные блоки несколько раз отмывали в 2- х мл буфера TE (3 раза по 3 часа ). Далее агарозу расплавляли при 65^° С , добавляли ацетат натрия до конечной концентрации 0.3 М , дважды экстрагировали фенолом , один раз фенол - хлороформом (1:1), один раз хлороформом , последний раз отбирали 350 мкл водной фазы . ДНК осаждали изопропанолом , промывали 70% этанолом , подсушивали и растворяли в 50 мкл воды . Выход ДНК был весьма значителен и составлял не менее 2 мкг ДНК на 1 г почвы .

Определение численности основных групп микроорганизмов проводили с использованием ПЦР с детекцией в реальном времени (Real-time). В качестве контроля для бактерий использовали клонированные фрагменты таксономически значимых генов : 16S рРНК Escherichia coli для количественного определения бактерий , 16S рРНК штамма FG-07 Halobacterium salinarum ( данные неопубликованы , Г . Ю ргенс , Университет Хельсинки ) для количественного определения архей , ITS штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae Meyen 1B-D1606 для количественного определения грибов . Были использованы следующие праймеры : Eub338/Eub518 – для бактерий [6], arc915f/arc1059r – для архей [7], ITS1f/5.8s – для грибов [6]. Указанные праймеры использовали для количественного определения штамма ГММ со следующим температурным профилем : 94° С – 10 с ; 63° С – 10 с ; 72° С – 30 с ; детекцию флюоресценции проводили при 72° С . Во всех случаях использовали Taq- полимеразу ( Хеликон ) – 2 ед . на реакцию , в реакционную смесь добавляли SYBR-green (Amresco) до конечной концентрации 0.3× и флюоресцеина изотиоцианат ( конечная концентрация 10 нм ). ПЦР с детекцией в реальном времени проводили в амплификаторе iCycler (BioRad) в трех повторностях . Для обработки результатов количественной ПЦР использовали программное обеспечение , прилагающееся к прибору iCycler. Количественные характеристики выражали в числе копий РНК - оперонов .

Анализ таксономической структуры микробных сообществ осуществлялся с помощью метода T-RFLP (terminal Restriction Fragments Length Polymorphysm) Для T-RFLP использовали следующие праймеры : 63f/1494r – для бактерий [8], Ar3f/Ar927r – для архей [9], ITS1/ITS4 [10], причем праймеры 63f, Ar3f, ITS1 были флюоресцентно мечены ( флюорофор D4, инфракрасный , для системы CEQ8000 Beckman Coulter, Sigma). ПЦР проводили с использованием Taq- полимеразы ( Хеликон ) со стандартным буфером с добавлением BSA до конечной концентрации 100 мкг / мл , в соответствии с указаниями упомянутых выше авторов . Тотальную почвенную ДНК разводили в 10 раз и использовали для ПЦР в количестве 1 мкл

1.00 Е +10

грибы          археи бактерии

1.00 Е +09

1.00 Е +08

1.00 Е +07

1.00 Е +06

1.00 Е +05

Сутки

уже заняты , а само сообщество находится в состоянии равновесия [12, 13, 14].

Заключение

Результаты наших исследований демонстрируют реальный потенциал современных молекулярных методов в экологии микроорганизмов . Их преимущество по сравнению с классическими бесспорно . Существующие на сегодняшний день методы молекулярно - генетического анализа позволяют в полной мере оценить структурно функциональные особенности микробного сообщества окружающей среды : идентификация таксономических групп различного уровня , определение структуры ( видового состава ) микробиологических сообществ , мониторинг штаммов ( генов ) в окружающей среде .

Молекулярная биология создает базу для развития новых технологий , влияние которых распространяется практически во все науки и всё глубже проникает в наш быт .

Работы осуществлялись при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований в рамках выполнения гранта РФФИ № 09-04-90815 и № 09-04-00386.

Теоретический и научно - практический журнал . Основан в 2005 году

Адрес редакции: 302019, г. Орел, ул. Генерала Родина, 69.

Сдано в набор 14.10.2010

Подписано в печать 28.10.2010 Формат 60х84/8. Бумага офсетная.

Гарнитура Таймс.

Объём 12,5 усл. печ. л. Тираж 300 экз. Издательство Орел ГАУ, 302028, г. Орел, бульвар Победы, 19.

Лицензия ЛР№021325 от 23.02.1999 г.

Ж урнал рекомендован ВАК Минобрнауки России для публикаций научных работ, отражающих основное научное содержание кандидатских и докторских диссертаций

Содерж ание номера