Перспективы поиска мультитаргетных ингибиторов топоизомераз с противоопухолевым действием

Основные характеристики ингибиторов топоизомераз с противоопухолевым действием

ДНК-топоизомеразы – ферменты, ответственные за регуляцию тoпологии ДНК. Некоторые из них являются специфическими мишенями таргет-ной терапии злокачественных новообразований. Ингибирование топоизомераз различных типов вызывает существенное торможение пролиферации клеток за счет образования разрывов цепи ДНК и препятствия лигированию после релаксации суперспирали [1–4]. В качестве терапевтических мишеней клинически значимых противоопухолевых препаратов признаны топоизомеразы человека I и II и две их изоформы – hTop1 и hTop2. Изучено большое количество ингибиторов различных изоформ фермента. Некоторые из них были эффективны, другие очень токсичны. Так, ингибиторы фермента типа IIA, образующие тройной комплекс «топоизомераза/лекарственное вещество/ДНК», вызывают разрывы ДНК без повторного связывания. Они тормозят репликацию ДНК и вызывают гибель клеток за счет генераций двунитевых разрывов (double-strand breaks, DSB), действуя как «топоизомеразные яды». Однако описаны некоторые хинолоны, ингибирующие hTop1 и hTop2, не вызывая «отравления», активные на опухолевых моделях [3, 5–7]. Поиск новых перспективных противоопухолевых ингибиторов топоизомераз определяется зависимостью их каталитической активности от структуры [8–17]. Оказалось, что независимо от типа фермента большинство из них проявляет значимую противоопухолевую активность, сопряженную с побочным действием различной направленности. Например, ингибиторы ДНК-топоизомеразы I камптотецинового ряда (камптотецин, иринотекан, топотекан и ламелларин D) быстро инактивируются при физиологическом pH, что связано с раскрытием лактонового кольца. Они характеризуются умеренной гемато- и серьез- ной нейротоксичностью. Соответственно, поиски новых клинических кандидатов направлены на соединения с заменой метаболически лабильного лактона камптотецина на более стабильный семичленный β-гидроксилактон (гиматекан, диф-ломотекан, гомокамптотецин, гиматекан и пр.), а также на получение кето-аналогов (S38809, S39625 и пр.) [18, 19]. Некамптотециновые ингибиторы ДНК-топоизомеразы I проявляют серьезную кардио- и умеренную нейротоксичность. Поиски менее токсичных соединений начаты и ведутся в рядах инденоизохинолонов, дибензонафтиридино-нов, индолокарбазолов и их углеводсодержащих производных (N6506, эдотекарин, мидостаурин, СЕР-701, энцестаурин, хинолон HU-331, ARC-111) [20–24].

Ингибиторы ДНК-топоизомеразы II типа включают производные подофиллотоксина (этопозид, тенипозид, вепезид) и антрациклинов (доксорубицин, даунорубицин, эпирубицин, неморубицин, идарубицин, митоксантрон, амсакрин). Среди чувствительных локализаций описан трудноку-рабельный гепатоцеллюлярный рак, развившийся на фоне хронической инфекции вирусами гепатита B или C [25]. Мишенью терапии этой опухоли служит топоизомераза II альфа (TOP2A), которая рассматривается также в качестве биомаркера для других локализаций [26]. Терапия антрациклинами сопровождается побочными эффектами, такими как местно-резорбтивное действие (при контакте с кожей), миело-, гастроинтестинальная токсичность и главное – неизлечимая дилатационная («доксорубициновая») кардиомиопатия. Последняя связана с угнетением не только ДНК-топоизомеразы II, но и с образованием свободных радикалов, в частности гидроксильных, обладающих высокой кумулятивной цитотоксичностью для кардиомиоцитов [27]. Эпиподофиллотоксины вызывают вторичные лейкозы, сопровождающиеся аберрацией в сегменте 11q23 [28]. Поиски некамптотециновых ингиби- торов топоизомеразы для клеточных мишеней hTop1 и hTop2 ведутся среди самых разнообразных химических структур.

Приведенные выше терапевтические и токсические характеристики ингибиторов топоизомеразы I и II обусловили поиск новых соединений с более высокой избирательностью действия. В этой связи описаны двойные или мультитаргетные ингибиторы топоизомеразы I/II, в частности бензофеназины (XR20 115761MLN 576), бензопиридоиндолы, тиохроманоны («топоизомеразный яд» CMFT), а также гетероциклические соединения (тиохромо-ны, линейные гетероаренантрацендионы и т. п.) [29–32].

Предпринятый в настоящем обзоре анализ литературы направлен на выявление перспективных ингибиторов топоизомеразы I/II в рядах фторхинолонов, индолохинолинов, нафтохинонов, хальконов (в том числе растительного происхождения), бензальдегидов, имидазопиридинов, гетероциклических конденсированных азотсодержащих соединений и пр. Последние включают уже известные производные фенантролина с уточнённым механизмом действия, а также нуклеозидные ингибиторы топоизомеразы, производные бензотиазола, антрафурандионы. Приведённый перечень основных химических групп является этапным и может быть расширен при соответствующей постановке задачи.

Результаты поиска новых ингибиторов топоизомераз

Остановка клеточного цикла в фазе G2/M клеточной линии рака лёгкого человека A549 под действием ципрофлоксацина была расценена как следствие ингибирования топоизомеразы II и послужила основанием для рекомендации его при злокачественной патологии легкого [33]. Молекулярный докинг 13 антибактериальных фторхино-лонов показал, что они образуют водородную связь и обладают хорошей аффинностью связывания с Top2α и Top2β человека, т.е. могут ингибировать активность топоизомеразы путём связывания её на активном участке. Самыми мощными ингибиторами оказались офлоксацин, спарфлоксацин, ципрофлоксацин и особенно моксифлоксацин, который образовывал комплексы с Тор2α и останавливал репликацию ДНК [34]. Новое бис-фторхинолоновое хальконподобное производное (авторский шифр HMNE3) было охарактеризовано как индуктор апоптоза с множественным ингибирующим действием в отношении Top2β и тирозинкиназы на клетках рака предстательной железы и 2 линиях рака поджелудочной железы – Capan-1 и Panc-1 [35, 36].

Для противомалярийного препарата криптолепина (Cryptolepine CRP, алкалоид из корней Cryptolepis sanguinolenta семейства Periplocaceae) из ряда индолохинолинов была показана цитотоксичность на 2 линиях беспигментной меланомы кожи человека, экспрессирующих Top1 и Top2 (SCC-13 и A431). При этом отмечено снижение топоизомеразной активности с индукцией апоптоза. Повреждение ДНК под действием криптолептина приводило к увеличению фосфорилирования ATM/ATR, BRCA1, Chk1/Chk2 и γH2AX, активации сигнального каскада p53, включая усиление экспрессии белков p16 и p21, и ингибированию циклинзависимых киназ, циклинов D1, A, E и белков, участвующих в делении клеток (например, Cdc25a и Cdc25b). В результате клеточный цикл был блокирован в S-фазе. Кроме того, нарушался мембранный потенциал митохондрий и происходило высвобождение цитохрома С [37].

Среди нафтохинонов особое внимание уделено лапахолу (4-гидрокси-3-(3-метилбут-2-енил) нафтален-1,2-дион) – веществу, выделенному из растений семейства Bignoniaceae . Лапахол проявил активность на опухолевых моделях in vitro, которая сопровождалась повреждением ДНК и индукцией апоптоза, а также in vivo на крысиной глиоме C6. Ингибирование активности Tор1 и Tор2 под действием лапахола проявлялось в релаксации суперспиральной ДНК. Механизм ингибирования Тор2 лапахолом был аналогичен механизму, описанному для этопозида. На основании полученных данных лапахол признан ингибитором топоизомеразы. Одно из аминопроизводных лапахола с пропиленовым заместителем в аминогруппе также показало активность на различных линиях клеток опухолей животных и человека (С6, LoVo, Эрлиха, К562). Производные с индольными каркасами были активны также на клеточной линии рака яичника человека Hela, при этом их цитотоксичность была сопряжена с индукцией апоптоза. Тест на Top1-опосредованную активность релаксации ДНК показал, что соединения (авторский шифр 4n и 4k) ингибируют Top1 более эффективно, чем камптотецин [38–41].

Среди хальконов интерес вызвали гетеро-ароматические циклические эпоксид- или тиоэпоксидзамещённые производные, более активно ингибировавшие Тор1 и более активные, чем кам-птотецин. Некоторые агенты этого ряда ингибировали функцию Тор2 сильнее, чем этопозид, а более активные (авторский шифр 9 и 13) были равно цитотоксичны для чувствительной (T47D) и устойчивой (MDA-MB468) к этопозиду линий клеток рака молочной железы человека [42].

Среди бензальдегидов был найден куминальде-гид, подавлявший цитопролиферацию с индукцией апоптоза. Одновременно он ингибировал активность Тор1, Тор2 и теломеразы в клетках аденокарциномы лёгкого A549, плоскоклеточного рака лёгкого NCI-H520 и аденокарциномы толстой кишки человека COLO205. Кроме того, куминальдегид был эффективен in vivo на ксенографтах опухолей человека, что позволило охарактеризовать его как ингибитор топоизомераз с противоопухолевым действием [43].

Среди имидазопиридинов в ряду имидазо-пиридинил-1,3,4-оксадиазольных конъюгатов найдено активное соединение (авторский шифр 8q, NSC:763639 , США), ингибирующее пролиферацию ряда клеточных линий опухолей человека с остановкой клеточного цикла в фазе G₁ и индукцией апоптоза в клетках A549. Данные верифицированы с помощью V-FITC , Hoechst -ядерного окрашивания, активации каспазы 3, измерения потенциала митохондриальной мембраны и детекции генерации АФК. Анализ Top2-опосредованной релаксации ДНК позволил выявить ингибирование активности фермента, а молекулярно-докинговые исследования – механизмы связывания с топоизомеразой (PDBID 1ZXN), что позволило отнести соединение к ингибиторам топоизомераз [44].

Гетероциклические конденсированные азотсодержащие соединения

Как правило, эффективность соединений подобной структуры основана на сочетании различных путей подавления пролиферации. Например, одно из платиновых соединений – фенантриплатин ( цис -[Pt(NH₃)₂(фенантридин)Cl](NO₃) – проявило себя как яд Top2 в дополнение к ингибированию ДНК- и РНК-полимеразы. При этом механизм образования ковалентного комплекса ДНК-платина иной, чем у известных топоизомеразных ядов, которые обычно оказывают свое действие путем обратимого связывания на границе раздела комплексов расщепления Top2-ДНК. Предполагается, что эта особенность открывает возможность разработки неклассических противоопухолевых агентов, способных преодолевать лекарственную резистентность к платиновым соединениям I поколения [45].

Весьма примечательные результаты получены в ряду акридинов, особенно природного происхождения. Один из них акроницин – алкалоид, выделенный из Acronchia baueri Schott (семейство Rutaceae ), проявивший активность против солидных опухолей в эксперименте, послужил основой для синтеза соединений с антипролиферативной и антитопоизомеразной активностью. Полученные из Amphimedon sp. и Xestospongia sp. пиридоа-кридины – амфимедин и неоамфимедин – обладают Top2-опосредованной цитотоксичностью, подтвержденной на восьми линиях опухолевых клеток. Неоамфимедин, показавший более высокую цитотоксичность in vitro, оказался активным также in vivo на подкожных ксенографтах колоректального рака человека HCT116. Интересен также асцидимин (алкалоид, выделенный из средиземноморского беспозвоночного Cystodytes dellechiajei ), ингибирующий активность Тоp2 и разрушающий ДНК. В ряду активных ингибиторов топоизомеразы II также стоят триазолоакридон, имидазоакри-динон и акридининдольные гибриды [46].

Совсем недавно в ряду нуклеозидных соединений выявлены селективные ингибиторы топоизомеразы II и гистоновых диацетилаз (histone deacetylase inhibitors, HDAC), для которых была показана зависимость ингибирующей активности от наличия в структуре фрагментов катехиновой природы. У нуклеозидных производных и промежуточных соединений их синтеза с TBS-группой (tret-butyldimethylsily, трет-бутилдиметилсилил) и/или 1,3-дитиановым фрагментом выявлена более высокая активность и селективность действия. На половине сигнальных линий клеток опухолей человека (панель NCI-60, США), нечувствительных к этопозиду, лучшим был агент с β-конфигурацией тиминового фрагмента (авторский шифр 25b) [47].

В ряду производных бензотиазола значимые результаты демонстрируют 1-иминоизоиндолины, замещённые амидинобензотиазолами и амидино-бензимидазолами изоиндолин-1-оны (авторский шифр: 3a-d; 4a-e; 3a-b; 4a-b; 3c-d; 4c-e соответственно). Для более эффективных соединений (авторский шифр 4а и 4b) показана активация митохондриального апоптотического пути в результате связывания с ДНК. Амидинзамещённые изоиндолин-1-оны (авторский шифр 4a-d) были более цитотоксичны по сравнению с амидинзамещёнными 1-иминоиоиндолинами (авторский шифр 3a-d), а соединения без амидиновой группы были цитотоксичны только для клеток эстрогенза-висимого рака молочной железы человека MCF-7. Взаимодействие с ДНК-спиралью амидинзамещённых производных (авторский шифр 3a-d и 4a-b), несущих положительный заряд, реализовалось через интеркаляцию спиральной канавки ДНК (спектры кругового дихроизма) аналогично разрыву ДНК, индуцированному топоизомеразой I. Локализуясь в ядре, они действовали в субмикро-молярном диапазоне, сопрягая ингибирование топоизомеразы II с индукцией апоптоза. Ядерная локализация для связывания с канавкой ДНК и ин-теркалирующий механизм действия, приводящий к выраженному «отравлению» топоизомеразы I, были сходны с камптотецином. Отсутствие значимых эффектов у амидинзамещённых производных 1-иминоиоиндолина (авторский шифр 3b-d) позволило предположить, что структуры типа изоиндолин-1-он+амидинобензотиазол с амидиновой группой имеют существенное значение для реализации антипролиферативной активности по типу Top2-отравляющего действия [48].

Наличие в этом ряду двойных ингибиторов Top1/2 различной структуры, которые проявляют родство к обоим ферментам и высокую цитотоксичность, определило широту поиска эффективных агентов. Показано, что большинство таких соединений практически полностью ингибирует топоизомеразную активность в опухолевой клетке и чрезвычайно эффективно in vitro и in vivo на большой панели клеток опухолей человека. Быстрое продвижение таких агентов в клинику позволило оценить целесообразность поисковых решений. В рамках клинических испытаний фазы I/II изучены двойные ингибиторы топоизомераз I/II: пиразолоакридин (pyrazoloacridine, PZA), бензопи-ридоиндольнинтоплицин, производные феназина (авторский шифр XR11576 и XR594), батрацилин и инденохинолинон (авторский шифр TAS-103), а также этопозидное производное тафлупозида гомокамптотецинэломотекан. Среди природных бензо[c]фенантридиновых алкалоидов четвертичные аммониевые соли фагаронина и нитидина умеренно подавляли активность топоизомераз I и II типов, а 11-замещённый 6-аминобензо[с]-фенантридинов и пиридо[3,4-с][1,9]фенантролин (авторский шифр P8-D6) эквипотентно ингибировал активность топоизомераз I и II типа и индуцировал апоптоз. По сравнению с клинически апробированными двойными ингибиторами, изученными на всей панели опухолей панели NCI-60, включая лейкоз и немелкоклеточный рак лёгкого, P8-D6 оказался сопоставимым по цитотоксичности с камптотецином [49].

Среди антрациклинов встречаются ингибиторы топоизомеразы двух типов. Структурной основой антрациклиновых противоопухолевых антибиотиков является тетрагидротетраценхиноновый хромофор, состоящий из шестичленного алифатического и трех ароматических колец. В химическом отношении они отличаются друг от друга заместителями в хромофоре и наличием сахарных остатков. К настоящему времени подавляющее число противоопухолевых антибиотиков (блеомицин, дактиномицин, митомицин, даунорубицин, доксорубицин, идарубицин, карубицин, эпирубицин) хорошо изучены. В составе схем комбинированной химиотерапии наиболее широко используется доксорубицин [50]. Подробно исследованы механизмы цитотоксического действия антрациклинов [51]. Они связаны главным образом с ингибированием синтеза нуклеиновых кислот путем интеркаляции между парами азотистых оснований, нарушением вторичной спирализации ДНК за счет ингибирования топоизомеразы II, а также связыванием с липидами клеточных мембран, сопровождающимся изменением транспорта ионов и клеточных функций, что обеспечивает высокую активность этих препаратов. В то же время эти агенты не проявляют достаточной избирательности противоопухолевого действия. Они проявляют различные виды токсичности, в том числе кардиотоксичность, лимитирующую их применение. Синтетический аналог даунорубицина – идарубицин не является исключением (Заведос®, Zavedos ®, Pfizer , США). В отличие от других антрациклиновых ингибиторов топоизомеразы II, идарубицин применяется перорально и высокоактивен в отношении более широкого спектра опухолей. Ингибиторов изомеразы I немного, и большинство из них находится в стадии разработки [52–55].

Исследования последних лет показали, что поиски двойных или мультитаргетных ингибиторов топоизомераз, обладающих противоопухолевой активностью, перспективны в ряду линейных ге-тероаренантрацендионов. Сравнительно недавно был открыт перспективный класс противоопухолевых ингибиторов топоизомераз на основе гетероциклических производных антрахинона, в частности производные антра[2,3-b]фуран-5,10-диона. Путем замещения пропоксигрупп диаминами была получена первая серия 4,11-диаминоантра[2,3-b]фуран-5,10-дионов, аналогов противоопухолевого препарата митоксантрон (аметантрон). Оказалось, что антрафурандионы более активны in vitro, чем конденсированные гетероаренантрацендионы с одним гетероатомом. Среди соединений с высокой цитотоксичностью наибольшую активность проявил антра[2,3-b] фуран-5,10-дион, содержащий дистальные метиламиногруппы. Особого внимания заслуживает его свойство оказывать выраженное ингибирующее влияние на рост клеточных линий с множественной лекарственной устойчивостью, избыточным синтезом Р-гликопротеина или делецией гена р53. Кроме того, это соединение блокировало in vitro TopI-опосредованное раскручивание ДНК [56, 57].

Соединения второй серии 4,11-диамино-антра[2,3-b]фуран-5,10-дионов с различными боковыми цепями отличались от предыдущих аналогов отсутствием алкильной группы в фурановом кольце и более высокой цитотоксичностью. Лучшие результаты получены с 2-незамещёнными производными, содержащими боковые амино-и метиламиногруппы. В этом ряду выявлены соединения с множественными механизмами цитотоксичности, включая ингибирование Top1/ Top2-опосредованной релаксации ДНК, снижение соотношения NAD+/NADH через ингибирование tNOX, подавление NAD+-зависимой активности деацетилазы Сиртуин 1 (SIRT1) и активацию каспазо-опосредованного апоптоза [58–59]. Впоследствии для противоопухолевых антрацен-9,10-дионов были открыты новые клеточные мишени в виде опухоль-ассоциированной NADH-оксидазы (tNOX) и SIRT1. При этом показано также, что антрафурандион дозозависимо подавляет трансляцию мРНК и синтез белка p21KRAS в опухолевых клетках в силу высокой аффинности к G-квадруплексам из 5'-нетранслируемого участка мРНК транскрипта онкогена KRAS [60]. Производное антрафуран-3-карбоксамида (Антрафуран, авторский шифр ЛХТА-2034) отличается наличием аминопирролидидкарбонильной группы в положении 3 гетероцикла, а также гидроксигрупп в положениях 4, 11. Это высокоэффективный мультитаргетный ингибитор топоизомераз I и II, множественный механизм антипролиферативного действия которого реализуется также в отношении протеинкиназ AurB и Pim. Как характерно для двойных ингибиторов, Антрафуран высокоактивен на линиях клеток с различными фенотипами множественной лекарственной устойчивости и на моделях опухолей in vivo, прогностически значимых для клиники. При доклиническом исследовании Антрафуран продемонстрировал высокую эффективность в отношении сингенных перевиваемых опухолей мышей при парентеральном и пероральном введении. Солюбилизация Антра-фурана с 2-гидроксипропил-β-циклодекстрином (HP-βCD) при стехиометрическом соотношении 1:1 привела к созданию хорошо растворимого комплекса, имеющего оптимальные химикофармацевтические показатели, что позволило разработать лекарственную форму для перорального применения [61–63]. Сигнальные функциональные группы для реализации антипролиферативной активности антрафуран-3-карбоксамидов выявлены при изучении серии аналогов антрафурана [64]. Доклиническое токсикологическое изучение Антрафурана показало, что при применении препарата в переносимых дозах его побочные эффекты выражены умеренно и полностью обратимы [65]. Приведенные данные позволяют надеяться, что мультитаргетный ингибитор топоизомеразы I и II Антрафуран при клинических испытаниях проявит преимущества перед монотаргетным ингибитором топоизомеразы II идарубицином и расширит арсенал пероральных противоопухолевых лекарств, позволяющих улучшить качество жизни больных и сократить время их пребывания в клинике.