Перспективы получения удвоенных гаплоидов растений семейства cucurbitaceae l

О сновные проблемы, на решение которых направлены усилия современной селекции – это полноценное питание людей, их здоровье, источники энергии. В России значительную долю среди овощей составляют растения семейства           Тыквенные

(Cucurbitaceae). Наибольшее хозяйственное значение среди них имеют огурец, тыква, кабачок, патиссон, дыня и арбуз. Плоды этих культур отличаются высокими вкусовыми и целебными свойствами. Их выращивают во всех регионах России, как в открытом, так и защищенном грунте. В условиях современного рынка потребительский спрос на овощную продукцию постоянно растет и меняется. Это создает необходимость наличия у селекционера генотипически раз- нообразного и стабильного материала, который позволит быстро удовлетворять требования современного производства. В мировой практике широкое распространение имеют гибриды F1, которые отличаются от сортов высокой вырав-ненностью и урожайностью, а также способствуют защите прав селекционеров и семеноводов. Создание гибридов требует использования

Рис.1. Получение DH-растений огурца в культуре неопыленных семяпочек. Прорастание семяпочки на среде МСм с 0,2 мг/л ter ТДЗ и 0,0001 мкМ эпибрассинолида (А). Развитие саженцев на без гормональной среде MС (Б). DH-растения огурца (В).

гомозиготных родительских линий, получение которых традиционными методами трудоемкое и длительное (6-8 лет), что сильно тормозит селекционный процесс.

Для решения этой проблемы большое значение имеет альтернативный метод создания гомозиготных линий из удвоенных гаплоидов (DH – doubled haploid). Из трех известных способов получения гаплоидов (андрогенез, гиногенез и партеногенез) у тыквенных культур наиболее успешно используется партеногенез.

По данным зарубежных исследователей с помощью партеногенеза можно получить 3-13 гаплоидов огурца на 1000 семян (Troung-Andre, 1988; Sauton, 1989; Przyborowski, Niemirowicz-Szczytt 1994; Caglar, Abak, 1999; Faris, Niemirowicz-Szczytt, 1999; Claveria et al., 2005; Xie et al., 2005). Для индукции партеногенеза у огурца, как правило, используют опыление женских цветков γ-облученной пыльцой с последующим выделением гаплоидных зародышей. Индуцированный партеногенез также широко применяют при получении гаплоидов у другого представителя рода Cucumis – дыни (Ficcadenti et al., 1995; Taner et al., 2000; Lotfi et al., 2003; Sun et al., 2006; Lim, Earle, 2009).

Отличие гиногенеза от партеногенеза заключается в том, что культивируются in vitro неопыленные завязи (фрагменты завязей) или семяпочки на искусственных питательных средах. Получение гаплоидных растений в культуре неопы-ленных семяпочек является результатом перехода клеток зародышевого мешка с гаметофитного пути развития на спорофитный с образованием из них эмбриоидов или морфогенного каллуса. На процесс индукции гиногенеза влияет большое число факторов таких, как генотип растения, стадия развития женского гаметофита, состав питательных сред, условия выращивания донорных растений, поэтому исследования в области гиногенеза сосредоточены на изучении их влияния на выход DH-растений. По литературным данным эффективность этих технологий следующая:

из 300 завязей огурца получается 240 эмбриоидов US Patent 5492827 (Dirk R., 1996); из 100 завязей – эмбриоидов (Gemes Juhans et

2002). Если учитывать, что в завязи огурца содержится 400-650 семяпочек в зависимости от сорта, то число получаемых DH-растений несколько меньше, чем при партеногенезе. В зарубежных селекцион- ных фирмах, несмотря на небольшой выход DH-растений, такого типа технологии позволяют получать их в промышленных масштабах (Dirk, 1996).

Поиски способов повышения выхода DH-растений в культуре неопыленных семяпочек проводятся учеными разных стран. Li с коллегами (2013) показали, что добавления нитрата серебра в питательную среду в концентрации 5-10 мг/л способствует побегообразованию у культивируемых семяпочек.

Во ВНИИ селекции и семеноводства разработана отечественная конкурентоспособная технология получения DH-линий огурца в культуре неопыленных семяпочек in vitro (рис. 1) (Шмыкова, Супрунова, 2009).

1. Регенерация растений огурца из неопыленных семяпочек огурца, культивируемых на модифицированной среде СВМ с тидиазуроном и эпибрассинолидом

Сортообразец	Число культивируемых семяпочек/завязей	Число семяпочек, образовавших растение	Число растений, полученных из одной завязи
№3	2571 (10)	80	8,0 ± 2,4
№7	2593 (10)	30	3,0 ± 1,1
№13	2342 (10)	200	20,0 ± 4,6
№24	2601 (10)	60	6,0 ± 1,9

.2. Получение DH – растений тыквы в культуре неопыленных семяпочек.

растание семяпочки на среде МСм с 0,2 мг/л ТДЗ и 0,0001 мкМ эпибрассино-лида (А). Развитие проростка гибрида № 100 на без гормональной среде MС (Б).

Применение для индукции гиноге-^э неза 0,2 мг/л тидиазурона в сочетании с 0,0001 мкМ эпибрассинолида позволило повысить регенерационную способность семяпочек. Полученные результаты превышали данные эксперимента, проведенного по методике Gemes Juhans с коллегами (2002) в несколько раз (3-20 раз в зависимости от образца) (табл. 1).

Вторым представителем семейства Тыквенные, имеющим большое хозяйственное значение, является род Cucurbita L. Для получения DH-растений различных представителей этого рода широко применяют партеногенез (Kurtar, 1999, 2009; Kurtar et al., 2002, Kurtar et al., 2009, Kurtar et al., 2010). Metwally с коллегами (1998a) и Shalaby (2007) сообщили об успешном использовании культуры неопыленных семяпочек тыквы.

Во ВНИИ селекции и семеновод- ства проведены успешные исследования по получению DH-растений у представителей рода Cucurbita через культуру неопыленных семяпочек (рис. 2). Донорные растения были представлены гибридами тыквы №100, 103, 104 и 112. Выделенные из завязей бутонов семяпочки помещали на питательную среду с минеральной основой МСм (Matsuda et al., 1984) с добавлением аминокислот (100мг/л пролина, 100 мг/л серина и 800 мг/л глутамина и витаминов по прописи NLN (Lichter, 1982), 30 г/л сахарозы, 7 г/л агара. Для индукции гиногенеза использовали два варианта регуляторов роста: первый вариант – 0,2 мг/л тидиазурона и 0,0001 мкМ эпи-брассинолида, второй – 2,0 мг/л 2,4Д.

Гибриды тыквы различались по частоте индукции гиногенеза в зависимости от варианта среды. У гибрида №100 индукция гиногенеза происходила лишь на среде с 0,2 мг/л тидиазурона и 0,0001 мкМ эпибрас-синолида, а у гибридов №103 и №112 – на среде с 2,0 мг/л 2,4Д, а гибриды №103 и №104 давали хороший результат на обеих средах. Максимальное число эмбриоидов, образовавшихся из одной завязи, было у гибрида №112 (9 штук), также хорошие результаты получены у гибрида №104 (6-7 штук эмбриоидов из одной завязи).

Культивирование семяпочек кабачка проводили на среде того же состава, что и тыквы. В опытах использовали 6 сортобразцов. Число вариантов индукционных сред было увеличено до 5. Они различались по содержанию регуляторов роста: 1 – 0,1 мг/л тидиазурона; 2 – 0,2 мг/л тидиазурона; 3 – 1,0 мг/л 2,4 Д; 4 – 2,0 мг/л 2,4 Д; 5 – 1,0 мг/л 2,4 Д и 1,0 мг/л кинетина. Сортобразцы проявили различную отзывчивость к индукции гиногенеза. Например, у образца №1 только одна неопылен-ная семяпочка проросла из 1220 штук культивируемых семяпочек. У самого отзывчивого сортообразца проросло 69 штук семяпочек из 1180 культивируемых. Эффективнее индукция гиногенеза происходила на средах с 1,0 мг/л 2,4 Д и 2,0 мг/л 2,4Д.

Б

Рис. 3. Получение DH – растений кабачка в культуре неопыленных семяпочек. А – прорастание семяпочек кабачка сортообра-зеца №2 на индукционной среде МСм с 1,0 мг/л 2,4 Д. Б – развитие проростка на безгормональной среде МС. В – развитие растения регенеранта на безгормональной среде МС.

Анализ зарубежного и отечественного опыта показывает перспективность разработок DH-технологий получения удвоенных гаплоидов у растений семейства Тыквенные через культуру неопыленных семяпочек in vitro, внедрение которых в селекционный процесс позволит ускорить создание отечественных, конкурентоспособных гибридов огурца, тыквы, кабачка.

Наряду с гиногенезом встречаются единичные сообщения о положи- тельных результатах при культивировании in vitro пыльников растений рода Cucurbita (Metwally et al., 1998b; Mohamed, Refaei, 2004;). В послед- нее десятилетие также активизировались исследования в культуре пыльников огурца (Kumar et al., 2003, 2004; Song et al., 2007). Однако, при культивировании пыльников огурца, как показали наши исследования, происходит образование каллуса из соматических тканей стенок пыльника и связника (Suprunova, Shmykova, 2008). Это усложняет отбор истин- ных

удвоенных

гаплоидов.

Результативных исследований культуры микроспор in vitro тыквенных культур на сегодняшний день нет, хотя именно это направление исследований является более привлекательным.

PROSPECTIVE OF DEVELOPMENT OF DOUBLED HAPLOID PLANTS OF CUCURBITACEAE FAMILY

Shmykova N.A., Khimich G.A., Korotseva I.B., Domblides E.A.

Federal State Budgetary Scientific Research Institution

«All-Russian Scientific Research Institute of vegetable breeding and seed production»

143080, Russia, Moscow region, Odintsovo district, p. VNIISSOK, Selectionnaya street, 14