Перспективы применения биомаркера "фактор роста эндотелия сосудов" при прогнозировании исходов лечения рака мочевого пузыря

¹ Введение. Рак мочевого пузыря (РМП) занимает заметное место в мировой статистике онкологической заболеваемости. Ежегодно в мире выявляется до 356 тыс. новых случаев заболевания. В течение последних десяти лет в России наблюдается постепенное увеличение заболеваемости РМП с 46 до 69 случаев на 100 тыс. населения [1, 2]. РМП подразделяют на две формы: немышечно-инвазивную (НМИРМП) и мышечно-инвазивную (МИРМП), последняя относится к одному из быстропрогрессирующих онкологических заболеваний. Без лечения больные с МИРМП погибают в течение 24 месяцев. Раково-специфическая выживаемость после радикальной цистэктомии, выполненной при МИРМП, составляет только 50%. НМИРМП после проведенного эндоскопического лечения рецидивирует в 60-70% случаев и в 15% переходит в МИРМП [3, 4]. В повышении эффективности методов лечения МИРМП наибольшее значение имеют методы оценки активности процессов опухолевого роста и контроля проводимого лечения [4–7]. В качестве одного из биомаркеров активности процессов опухолевого роста и метастазирования в настоящее время рассматривается фактор роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor — VEGF) [8–12].

В исследованиях последних лет показано, что подъем уровня VEGF в сыворотке крови при злокачественных новообразованиях связан с гипоксией опухолевой ткани и накоплением в ней ассоциированных с опухолью макрофагов (TAMs), отличных от нормальных макрофагов ткани (MTMs) [13, 14]. В участках гипоксии опухолевой ткани усиливается как образование индуцируемого гипоксией фактора-1 (HIF-1- регулятор экспрессии VEGF-А), так и образование проангиоген-ных факторов при участии TAMs [15, 16]. Следствием нарастания выработки VEGF в опухолевой ткани становятся повышение проницаемости вновь образованных сосудов, увеличение интерстициального и внутриопухолево-го давления, проникновение опухолевых клеток в кровоток и метастазирование [17, 19, 20]. Значение опухолевого ангиогинеза активно изучается и широко обсуждается с момента опубликования J. Folkman исследований (1971-1976), посвященных роли активации ангиогенеза в развитии злокачественных новообразований [21–23]. Однако в настоящее время представлены немногочисленные и порой противоречивые данные ретроспективных исследований, в которых проведен анализ диагностического значения изменения уровня VEGF в сыворотке крови у больных РМП в динамике проводимого лечения.

Цель: провести анализ диагностического значения VEGF при прогнозировании исходов лечения РМП.

Материал и методы. В исследовании, проведенном с 2010 по 2016 г., приняли участие 264 человек, находившихся на обследовании и лечении в клинике урологии ФГБОУ ВО «Саратовский ГМУ им. В. И. Разумовского». В числе обследованных было 85 (32%) женщин и 179 (68%) мужчин от 44 до 79 лет. Из 264

человек обследованных больных раком мочевого пузыря было 204 человека. В группу сравнения включены 60 человек: 30 условно здоровых лиц от 21 года до 40 лет и 30 человек от 41 года до 60 лет, так как установлено, что с возрастом происходит повышение VEGF в сыворотке крови [24]. Отбор больных с РМП проведен в соответствии с клиническими критериями включения и исключения.

Критерии включения в исследование:

• —    пациенты с переходно-клеточным (уротелиальным) РМП: стадии Та-4N0-3M0-1;

• —    первично выявленный РМП без предшествующего специального лечения (оперативное лечение, химио-, иммуно- или лучевая терапия);

• —    рецидивный РМП без лечения, направленного на данный рецидив;

• —    отсутствие острой задержки мочеиспускания, требующей установки уретральных катетеров, на момент забора биоматериала на исследование.

Критерии исключения:

• —    верифицированный при гистологическом исследовании тип опухоли: аденокарцинома, саркома, лейомиома и другие (не переходно-клеточный рак);

• —    наличие опухолей других локализаций (в т.ч. рак лоханки и мочеточника, рак простаты);

• —    неотложные состояния (острый инфаркт миокарда, острое нарушение мозгового кровообращения, тромбоэмболия легочной артерии);

• —    почечная и печеночная недостаточность;

• —    заболевания сердечно-сосудистой системы атеросклеротического генеза;

• —    артериальная гипертония 3–4-й стадии.

До оперативных вмешательств все пациенты были распределены в соответствии со стадией заболевания и видом оперативного вмешательства (табл. 1).

Таблица 1

Распределение больных РМП по стадиям заболевания и видам оперативных вмешательств

Группа обследованных	Стадия заболевания	Виды оперативных вмешательств
НМИРМП, n=75	Та-1NxMo, n=75	ТУР стенки мочевого пузыря с опухолью, n=75
МИРМП в пределах органа, n=69	рТ2аN0M0- -Т2bN0M0, n=69	радикальная цистэктомия, n=117; открытая резекция мочевого пузыря, n=9; паллиативные операции, n=3
МИРМП с прорастанием опухоли в параве-зикальную клетчатку и окружающие органы, n=60	рT 3а-б N 0 M 0, n=41; рТ3бN1M0, n=11; рТ N M , n=5; Т4N1M0, n=3

Опухоли имели следующие градации: G1–97; G2– 37; G3–58.

Из 60 больных с МИРМП у 19 имелось метастатическое поражение подвздошных лимфатических узлов, установленное только после операции. У 3 пациентов из 19 больных МИРМП кроме лимфоузлов метастазы обнаружены также в легких.

Срок наблюдения за пациентами после оперативного лечения составил 3,5±0,5 года. Из 75 больных НМИРМП у 27 (36%) в первый год после ТУР выявлен рецидив заболевания. Из них у 11 (14,6%) человек диагностирована прогрессия заболевания: у 4 (5,3%) пациентов — переход из стадии Та в стадию Т1, а у 3 (4%) — переход из НМИрМп в МИРМП. Из 126 радикально оперированных больных МИРМП в течение 12-18 месяцев у 32 (27,7%) человек возник рецидив заболевания: в 6 (50%) случаях после резекции мочевого пузыря и в 27 (23,4%) после цистэктомии. В данной группе больных МИРМП в течение двух лет 38 (29,4%) больных умерли от прогрессии онкологического заболевания, 91 (70,6%) пациент находится под наблюдением.

В дооперационном периоде проведен комплекс обследования, который помимо сбора жалоб, анамнеза и осмотра пациента включал: стандартное лабораторное обследование (ОАК, ОАМ, содержание мочевины и креатинина крови, цитологическое исследование осадка мочи); инструментальные неинвазивные и малоинвазивные методы (УЗИ почек, мочевого пузыря, в т.ч. ТРУЗИ и ТВУЗИ, простаты у мужчин, печени, регионарных лимфоузлов); обзорная и экскреторная урография с выполнением нисходящей цистограммы; рентгенография легких (с целью исключения метастазов); МРТ органов малого таза. У 20 (26,7%) пациентов проведена цистоскопия с цито- и гистологическими исследованиями биопсийного и операционного материала.

В качестве дополнительных лабораторных тестов всем обследованным методом твердофазного ИФА проведено исследование в сыворотке крови содержания VEGF с использованием наборов реактивов АО «Вектор Бест» (Новосибирск).

Исследование уровня VEGF всем больным РМП проводили до начала хирургического лечения. Повторный забор биоматериала (кровь) для определения уровня VEGF через 12–18 месяцев после оперативного лечения проводили у 27 больных НМИРМП с рецидивами в 1-й год после хирургического лечения и у 48 остальных пациентов при безрецидивном течении заболевания. В послеоперационном периоде повторное определение содержания в сыворотке крови VEGF было проведено 63 пациентам, разделенным на две аналитические группы: без и с рецидивами заболевания через 12–18 месяцев после оперативного лечения. Сроки повторного проведения исследования уровня VEGF у больных РМП (через 12–18 месяцев после оперативного вмешательства) выбраны не случайно, в эти сроки послеоперационного периода чаще всего развиваются рецидивы заболевания и метастазирование .

Для математического и статистического анализа полученных результатов использовались пакеты компьютерных программ Statistica 6.0 (Stat Soft Inc.), SPSS 13.0 for Windows (SPSS Inc.), Microsoft Office Excel 2007. Для определения вида распределения данных в выборке использовались критерии Колмогорова — Смирнова и Шапиро — Уилка. В процессе статистической обработки использовались методы непараметрического анализа, который включал вычисление медианы, квартилей вариационного ряда, максимальных и минимальных значений. В качестве критерия достоверности отличия между двумя независимыми группами использовался непараметрический критерий (U) Манна — Уитни. Чувствительность и специфичность представленных методик диагностики определялись с помощью построения характе- ристической кривой (ROC-анализ) при разных точках разделения значений лабораторных показателей.

Результаты. Анализ полученных результатов показал, что повышение содержания VEGF сыворотки крови есть у пациентов в группах с НМИРМП и МИРМП. Вместе с тем как в до-, так и в послеоперационном периоде степень повышения показателя у больных НМИРМП и МИРМП имеет значительные различия, связанные с размерами опухолевой ткани, активностью инвазивного роста и метастазирования.

В группе больных НМИРМП содержание VEGF в сыворотке крови до оперативного вмешательства увеличено только при сравнении с группой практически здоровых лиц в возрасте от 21 года до 40 лет. По сравнению с уровнем показателя в группе сравнения в возрасте от 41 года до 60 лет величины VEGF у больных НМИРМП снижены в 1,94 раза (p<0,05).

У больных МИРМП до оперативного вмешательства содержание VEGF превышало его величины в группе сравнения в возрасте от 41 года до 60 лет (табл. 2.). У больных МИРМП в пределах органа уровень VEGF сыворотки крови превышал его содержание в указанной группе в 1,5 раза; в группе больных МИРМП при прорастании опухоли в паравезикаль-ную клетчатку и окружающие органы — в 1,9 раза (p<0,05).

Таблица 2

Содержание VEGF в сыворотке крови у больных РМП до оперативного вмешательства

Группа обследованных		VEGF пг/мл
Группа сравнения	от 21 до 40 лет, n=30 от 41 до 60 лет, n=30	272 (171,6-349,05) 675,15 (550,3-776,1)
НМИРМП, n=75		348,5* (220,5-600,4)
МИРМП, 2a-bN0M0, n=69		1031,6** (772,4-989)
МИРМП, T3b-T4N0-1M0–1, n=60		1313,7** (769,5-1858,5)

П р и м еч а н и е : в табл. 2 и 3: * — p<0,05 по критерию Манна — Уитни, при сравнении с группой сравнения в возрасте от 21 до 40 лет; ** — p<0,05 по критерию Манна — Уитни, при сравнении с группой сравнения в возрасте от 41 до 60 лет; данные представлены в виде медианы и квартильного диапазона.

В послеоперационном периоде у больных НМИРМП без рецидивов содержание VEGF сыворотки крови оставалось на уровне нижних границ возрастной нормы.

В группе больных с рецидивами заболевания уровень VEGF сыворотки крови незначительно превышал его содержание до оперативного пособия и был в 1,3 раза выше его величины в группе сравнения для возрастной категории от 21 года до 40 лет (p<0,05) (табл. 3). У пациентов МИРМП с рецидивом и метастазами содержание VEGF превышало величину показателя группы сравнения в возрасте от 41 года до 60 лет в 1,6 раза (p<0,05). У больных МИРМП без метастазов и рецидивов показатель снизился в 0,7 раза по отношению к его величине в группе сравнения в возрасте от 41 года до 60 лет (p<0,05).

Различия в степени подъема уровня VEGF сыворотки крови, связанные с прогрессией опухолевого роста, развитием рецидивов и метастазов, показали целесообразность определения диагностической

Таблица 3

Содержание VEGF сыворотки у больных РМП после оперативного вмешательства через 12–18 месяцев

Группа обследованных VEGF пг/мл Группа сравнения от 21 до 40 лет, n=30 от 41 до 60 лет, n=30 272 (171,6-349,05) 675,15* (550,3-776,1) Больные с рецидивами НМИРМП, n=27 376,8* (58,3-684,3) Без метастазов и рецидивов МИРМП, T2-T3aN0M0, n=38 506,8* (414,3-584,3) С метастазами и рецидивами МИРМП, Т4N2-3M1, n=25 1121,9** (914,8-1368) значимости подъема величин показателя у больных НИМРМП до оперативных вмешательств и у пациентов МИРМП в до- и послеоперационном периоде.

Анализ диагностической значимости VEGF у больных НМИРМП в качестве маркера активности опухолевого роста и инвазии проведен с учетом кривой ROC и рассчитанного порогового значения. Пороговый уровень VEGF для прогноза развития рецидивов в послеоперационном периоде у больных НМИРМП выявлен по наиболее оптимальному сочетанию значений чувствительности и специфичности. Для его определения строили графики зависимостей чувствительности и специфичности от концентрации VEGF сыворотки крови и находили искомую концентрацию в точке пересечения построенных кривых. Пороговый уровень VEGF, значимый для прогноза развития рецидивов в послеоперационном периоде, у больных НМИРМП составил 266,1 пг/мл (чувствительность 92,3%, специфичность 61,5%). Уровень показателя выше порогового значения имелся у 27 пациентов НИМРМП до оперативного вмешательства. В 100% случаев у пациентов НИМРМП с уровнем VEGF выше 266,1 пг/мл через год после ТУР выявлены рецидивы заболевания.

У больных МИРМП кривая ROC и пороговое значение VEGF сыворотки крови, подтверждающее развитие рецидивов и метастазов в послеоперационном периоде, составили 796,92 нг/мл (чувствительность 71,4%, специфичность 87,5%). Уровень VEGF сыворотки крови в послеоперационном периоде выше порогового значения выявлен у 25 больных МИРМП с рецидивами и метастазами заболевания. Метастазы в легочной ткани крови лимфоузлов имели 3 пациента. Смертность больных данной группы в течение двух лет достигла 100%.

Обсуждение. В до- и послеоперационном периодах отсутствие подъема уровней VEGF в сыворотке крови у больных РМП дает основание считать, что клетки иммунной системы сохраняют достаточно высокую активность противоопухолевого иммунного ответа. В настоящее время VEGF сыворотки крови при онкологических заболеваниях рассматривается не только как индикатор процессов «включения» опухолевого ангиогенеза, но и как маркер «иммунного редактирования» опухолевого роста. Нарастание уровня VEGF сыворотки крови считается следствием подавления противоопухолевых защитных свойств клеток иммунной системы. Эти процессы определяют выявленные различия в степени нарастания VEGF сыворотки крови в до- и послеоперационном периодах в группах больных НИМРМП и МИРМП. Нарастание уровня показателя у больных НМИРМП, не выходящее за пределы возрастной нормы, свидетельствует о локализации процесса в пределах опухолей ткани и достаточно высокой активности механизмов противоопухолевого надзора организма. У пациентов МИРМП высокие концентрации в периферической крови VEGF являются следствием процессов уклонения опухолевого роста от иммунного ответа. Гипоксия при прогрессии опухолевого роста создает условия репрограммирования, поляризации и активации иммуносупрессирующих свойств клеток иммунной системы опухолевого микроокружения. Лимфоциты и макрофаги, мигрируя в очаг опухолевого роста, начинают секретировать целые ростовые факторы (VEGF и др.), которые усиливают пролиферативную активность опухолевой ткани, рост сосудов и привлекают в очаг другие лейкоциты и макрофаги. Модуляция цитокинпродуцирующей функции клеток опухолевого микроокружения (лимфоцитов, макрофагов), повышение интерстициального давления, ограничение доступности питательных веществ и кислорода с формированием гипоксических зон, производство активных форм кислорода, атаки иммунной системы у больных МИРМП приводят к увеличению выброса VEGF не только в пределах опухолевой ткани, но и в системный кровоток. Это дает основание считать, что по степени нарастания содержания VEGF сыворотки крови можно провести оценку противоопухолевых защитных свойств клеток иммунной системы опухолевого микроокружения у больных НМИРМП и МИРМП как до оперативного вмешательства, так и в послеоперационном периоде. Таким образом, нарастание уровня VEGF в сыворотке крови у больных РМП позволяет установить характерные этапы перехода опухолевой ткани к агрессивному росту и метастазированию и обосновать целесообразность применения данного показателя для прогноза исходов лечения заболевания в до- и послеоперационном периодах.

Выводы:

• 1.    Нарастание уровня VEGF в сыворотке крови до и после оперативных вмешательств у больных НМИРМП и МИРМП характеризует активность процессов опухолевого роста до оперативного вмешательства и развитие рецидивов и метастазов в послеоперационном периоде.

• 2.    Подъем уровня VEGF в сыворотке крови у больных РМП в группах больных с НМИРМП и МИРМП имеет существенные различия и характеризует активность защитных свойств клеток иммунной защиты на уровне опухолевого микроокружения.

• 3.    Установлен пороговый уровень VEGF сыворотки крови больных НМИРМП до операции для прогноза риска развития рецидива в течение первого года после ТУР: выше 266,1 пг/мл (чувствительность 92,3%, специфичность 61,5%).

• 4.    Нарастание уровня VEGF в сыворотке >796,92 нг крови больных МИРМП является показателем прогноза риска регионального метастазирования (чувствительность 71,4%, специфичность 87,5%).